广东和山东地区鼻咽癌组织EB病毒BART miRNAcluster 1多态性比较

高龙峰,王巧祎,张增霞,王云

(青岛大学,山东 青岛 266071 1 基础医学院病原生物学系; 2 附属心血管病医院检验科)

EB病毒(EBV)在人群中普遍感染,但鼻咽癌(NPC)、Burkitt’s淋巴瘤和结外NK/T细胞淋巴瘤等EBV相关肿瘤的发病呈明显的地域性分布[1-3],其中NPC只在中国南方部分地区(广东、香港、广西和湖南等)和东南亚高发[1]。造成EBV相关肿瘤地域性分布的原因尚不明确,可能与病毒、遗传和环境等多种因素相关[1-3]。是否存在与EBV相关肿瘤发生及地域性分布相关的EBV基因变异是肿瘤病因学研究的热点。以往研究多针对EBV编码蛋白的基因进行[4-7],较少关注其非编码基因。EBV是第一个被确认编码微小RNA(miRNA)的人类病毒,共编码44个成熟的miRNA,其中40个由BamHⅠ A右向转录产物(BART)生成。BART区域又分为cluster 1和cluster 2两个区域,其中cluster 1区域包含8个miRNA前体和14个成熟miRNA,cluster 2区域包含有14个miRNA前体和26个成熟miRNA[8-9]。研究表明,BART miRNA在病毒持续性感染和肿瘤发生发展过程中起重要作用[9-11]。最近有研究对BART miRNA启动子区域和BART miRNA cluster 2区域进行了序列分析,发现这些基因也存在变异,且某些变异可能与肿瘤相关[12-14],但目前尚无对cluster 1区域基因多态性分析的报道。本研究检测广东地区(NPC高发区)和山东地区(NPC低发区)NPC和健康人群中BART cluster 1基因变异情况,探讨该基因变异与NPC的关系,以期为揭示EBV基因变异在肿瘤发生中的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

广东地区样本取自中山医科大学第一附属医院和第三附属医院,山东地区样本取自青岛大学附属医院。NPC样本为经病理学检查确诊的石蜡包埋组织;健康人群样本为取自健康查体人员的咽漱液,其性别及年龄与NPC病人匹配且排除肿瘤病史。石蜡包埋组织和咽漱液标本DNA提取和EBV阳性标本鉴定的具体方法和步骤见文献[15]。对EBV阳性标本进行BART miRNA cluster 1序列测定,成功获得序列的296例样本纳入本研究。其中广东地区NPC病人79例,男58例,女21例,年龄26～69岁,平均(48.63±10.61)岁;健康人群59例,男45例,女14例,年龄27～69岁,平均(49.41±9.85)岁。山东地区NPC病人104例,男79例,女25例,年龄11～71岁,平均(48.16±12.71)岁;健康人群54例,男40例,女14例,年龄24～69岁,平均(48.19±11.42)岁。NPC和健康人群之间及两个地区人群性别和年龄构成差异均无显著性(P>0.05)。所有NPC病人和健康人群均为汉族,广东地区样本来自祖籍为广东的当地居民,山东地区样本来自祖籍为山东的当地居民。

1.2 BART miRNA cluster 1基因序列分析

采用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在线设计引物,扩增区域包括完整的BART cluster 1序列,在EBV标准株EBV-RefSeq(GenBank收录号:NC_007605)中的位置为nt139087-140093[4]。引物及其序列见表1。采用巢式PCR对BART cluster 1序列分两段进行扩增。外巢PCR扩增体系为20.0 μL,其中包括2×PCR 预混液(Taq Green PCR Master Mix,美国赛默飞世尔科技公司)10.0 μL,上下游引物各0.8 μL(0.4 μmol/L),DNA 模板2.0 μL(100 ng),去离子水6.4 μL。循环条件为:94 ℃预变性30 s;然后98 ℃变性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,扩增35个循环;最后72 ℃延伸3 min。内巢PCR的反应体系为30 μL,包括:2×PCR预混液15.0 μL,上下游引物各1.2 μL(0.4 μmol/L),模板1 μL外巢PCR产物,去离子水11.6 μL;循环反应条件同外巢PCR。分别用EBV阳性细胞系Raji和EBV阴性细胞系HONE1提取的DNA作为PCR反应的阳性和阴性对照。

表1 BART miRNA cluster 1基因多态性检测所用引物

采用末端终止法对25 μL 内巢PCR产物进行双向测序,测序由北京华大基因有限公司完成。用Chromas软件查看测序峰图文件,以EBV-RefSeq作为参比序列,采用Lasergene软件(version 7.0)进行序列剪接和对排[16]。

1.3 系统进化树分析

采用MEGA 7.0软件,将本研究所获得的广东地区和山东地区BART cluster 1序列用Clastal W方法进行比对,采用临接法根据进化距离绘制系统进化树[17]。

1.4 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计数资料比较采用Fisher确切概率法或χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BART miRNA cluster 1基因序列变异

本文296例样本测序成功。与EBV-RefSeq比较,296条序列均出现单核苷酸突变,其中251条序列同时伴有插入和(或)缺失。插入和缺失主要位于3个位置。①nt139196-139209:EBV-RefSeq在此处形成14个单碱基G重复序列,标本序列在此处的碱基G数量为7～19个,从而形成插入或缺失,236条序列出现1～7个碱基G缺失,有5条出现插入。②nt139612-139613:248条序列在nt139612-139613之间插入1个碱基T,1条插入碱基C,1条插入碱基G。③nt140056-140062:EBV-RefSeq在此处形成7个单碱基T重复序列,标本序列在此处的碱基T数量为0～7个,共220条序列出现1～7个碱基T缺失。

本文296条序列的单核苷酸突变情况见图1。由图1可见,出现相同突变的序列以1例标本序列作为代表,共发现47条不同序列。共出现突变49处,其中≥2例样本出现突变22处,A139600G、G139628A和T139650C见于所有样本,A139654C见于295例样本,G139196C、G139199T、G139200T和C139210A位于nt139196-139-209单碱基重复序列部位。根据其他部位出现的共有突变及系统进化树对BART miRNA cluster 1序列变异进行分类,共分为4种变异型,命名为BART-A、-B、-C和-D,BART-B和-D又进一步分为2种亚型(BART-B1和-B2;BART-D1和-D2)。

本文研究20例样本(6.8%)为BART-A变异型,其共有突变包含上述4处见于所有样本的突变。BART-B变异型除上述4处突变外,还出现1处共有突变,为T139657G;另外4处突变T139684C、A139784G、C139946T和T140002G呈不同组合,其中包含共有突变T139657G和另外1处突变T139684C或T140002G的序列分类为BART-B1亚型,包含共有突变T139657G和另外4处突变中的2～4处突变的序列分类为BART-B2亚型(均出现C139946T突变),二者分别见于8例(2.7%)和33例(11.1%)样本。BART-C变异型出现3处突变T139193G、T139882C和A139932C或其中2处突变,见于5例(1.7%)样本。BART-D变异型除见于所有样本的4处突变外,还含有2处共有突变A139441G和A139496G,其中又出现共有突变C139946T的序列分类为BART-D2亚型,其余为BART-D1亚型,二者分别见于124例(41.9%)和106例(35.8%)样本。

2.2 系统进化树分析

以47条不同序列绘制系统进化树,系统树分为2大支,其中一支包含3个主要分支,分别对应3个变异型:BART-A、-B和-C;另外1支对应BART-D。BART-B和-D又分为不同分支,结合其突变特点分别分为2个亚型(图2)。

47条不同序列分别以1例标本序列作代表,标本名称后括号中数字表示与该标本序列单核苷酸突变相同的样本数。

2.3 BART miRNA cluster 1基因变异类型在广东和山东地区标本中的分布

广东地区NPC和健康人群中BART miRNA cluster 1变异型(亚型)的分布不同,主要表现为NPC以BART-D2亚型为主;而健康人群除BART-D2外,BART-B2和-D1的比率亦较高,BART-D2在NPC中的检出率(86.1%,68/79)高于健康人群(44.1%,26/59),差异有显著性(χ2=27.444,P<0.001)。见表2。

表2 两地区NPC和健康人群中BART miRNA cluster 1变异型/亚型分布(例(χ/%))

山东地区NPC和健康人群中BART miRNA cluster 1变异型的分布亦不同,主要表现为健康人群以BART-D1亚型为主;而NPC中除BART-D1外,BART-D2和-B2的比率亦相对较高,BART-D2在NPC中的检出率(27.9%,29/104)高于健康人群(1.8%,1/54),差异有统计学意义(χ2=15.660,P<0.001)。见表2。

广东和山东地区NPC人群间BART miRNA cluster 1变异类型的分布不同,其主要表现为广东地区NPC主要为BART-D2亚型,而山东地区的BART-D1亚型相对较多,广东地区NPC中BART-D2的检出率高于山东地区NPC,差异具有显著性(χ2=61.032,P<0.001)。广东和山东地区健康人群之间BART miRNA cluster 1变异类型的分布亦不同,表现为山东地区健康人群主要为BART-D1亚型,而广东地区健康人群中BART-D2和BART-B2检出率高于山东地区健康人群,差异有显著性(χ2=27.632、14.083,P<0.001)。见表2。BART-A、BART-C和BART-B1仅见于少数样本,未表现出地区和人群分布差异。

3 讨 论

本研究首次对广东和山东地区NPC和健康人群中EBV BART miRNA cluster 1序列进行了分析,结果显示,与EBV标准株比较,所有样本均出现变异,包括单核苷酸突变、插入和缺失。依据特征性突变和系统进化树,BART miRNA cluster 1基因可被分为6种变异型/亚型,对不同地区样本的分析表明,BART miRNA cluster 1基因变异存在地区差异。最主要的地区差异表现为BART-D1和BART-D2两个变异亚型分布不同,BART-D2主要见于广东地区,是NPC中的主要亚型,也是健康人群中检出率最高的亚型;而BART-D1亚型主要见于山东地区,是健康人群中的主要亚型,也是NPC中检出率最高的亚型。BART-D2在广东地区NPC和健康人群中的检出率均显著高于山东地区,差异有显著性。

BART-D2不仅与地域相关,也呈现疾病相关性。在广东地区和山东地区NPC中的检出率均显著高于同一地区健康人群,提示BART-D2与NPC的发生相关。既往研究表明,同一个体不同样本如癌组织、咽漱液和血液中多个EBV编码基因的变异相同,提示其毒株来源相同[18-20]。因此,标本类型的差异不影响NPC肿瘤组织与健康人群咽漱液标本比较的结果。

本研究结果显示,BART-D2在广东和山东地区的分布特点与既往研究报道的EBER基因EB-8m变异型类似,EB-8m在广东和山东地区NPC中的检出率分别为82.0%(41/50)和33.7%(32/95),在健康人群中的检出率则分别为32.4%(24/74)和1.1%(1/92)[21]。BART-D2亚型在广东地区的分布特点与既往香港地区的NPC-EBERvar变异型和广东地区BALF2基因的单核苷酸多态性(SNP)163364T类似,NPC-EBERvar在香港NPC和健康人群中的检出率分别为96.8%(60/62)和 40.1%(57/142),SNP 163364T在广东地区NPC人群和健康人群中的检出率分别为84.98%(543/639)和45.71%(298/652)[22-23]。EB-8m、NPC-EBERvar及SNP 163364T均被报道在中国NPC高发区流行,且与NPC发病风险相关[21-24]。本文初步利用GenBank中已发表EBV基因组序列,对BART-D2与163364T做了关联分析,结果显示在同一基因组中BART-D2几乎总是与163364T同时出现,它们之间存在连锁不平衡,进一步提示BART-D2与NPC相关。

目前,有少数研究对BART miRNAs编码区域的基因多态性进行了分析。KIM等[12]研究显示,BART启动子区域nt138557位点碱基G缺失可提高BART启动子活性,且该缺失SNP即G138857在NPC来源的EBV基因组中的检出率(83.10%)高于GC来源的EBV基因组(46.43%)。KIMURA 等[14]研究发现,在部分结外NK/T细胞淋巴瘤、慢性活动性EBV感染和弥漫性大B细胞淋巴瘤中存在BART区域不同程度的缺失。CORREIA等[13]比较了不同地域的EBV基因组中BART miRNA cluster 2序列,发现3种主要变异型,而且NPC高发区NPC来源的EBV毒株M81 BART miRNA cluster 2的突变可影响某些成熟miRNA的表达水平,推测BART miRNA cluster 2区域的变异可能通过影响miRNA的表达水平,进而影响miRNA的功能。M81毒株在BART miRNA cluster 1区域亦为BART-D2亚型,BART-D2对其编码miRNA表达及功能的影响有待进一步研究。

综上所述, BART miRNA cluster 1基因变异既与地理位置相关,又存在疾病相关性,BART-D2变异型可能主要在我国NPC高发区流行,并且与NPC的发生相关。进行多地区和多疾病来源的大样本流行病学研究以及功能学研究将有助于明确BART-D2基因变异在NPC发生中的作用。