藏药二十五味鬼臼丸对雌性去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢平衡的影响※

余 瑶,李沁园,代冬芳,李凤辉,段方林,马莉娜,李长兴

(青海大学医学部,西宁 810001)

研究发现,藏药二十五味鬼臼丸对雌性去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢平衡有影响,但无定量数据且影响机制不明。本课题拟通过大鼠双侧卵巢切除术建立雌性去卵巢骨质疏松大鼠模型,研究藏药二十五味鬼臼丸对去卵巢大鼠雌激素水平、骨代谢相关生化指标、骨生物力学的影响,探索其治疗绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)的可能机制,以期拓宽藏药二十五味鬼臼丸的临床应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

48只SPF级3月龄SD雌性大鼠,体质量(200±20)g,由西安交通大学医学部实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK(陕)2018-001。饲养于明暗交替、室温为(22±1)℃ 的环境中,自由摄食(水)。本研究经青海大学医学院实验动物伦理委员会批准(批准号QHDX2021000541)。

1.1.2 药物与试剂

戊酸雌二醇片(BJL,拜耳医药保健有限公司,国药准字为J20171038);藏药二十五味鬼臼丸(GJW,青海柴达木高科技药业有限公司,国药准字为Z63020209)。雌二醇(E2)、抗酒石酸酸性磷酸酶5 b(TRAP5b)、骨钙素(OC)酶联免疫吸附测定法ELISA试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司,批号分别为MB-2116B、MB-1947A、MB-6757B),促黄体生成素(LH)ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,批号为E-EL-R0026c),无机钙ELISA试剂盒(上海臻科生物科技有限公司,批号为ZK-6898),TRAP/ALP双重染色试剂盒(日本Wako公司,批号为294-67001)。

1.1.3 仪器

Centrifuge 5418R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);Ci-S型荧光显微镜(日本Nikon公司);Instron E10000万能材料力学仪(美国Instron公司),多功能酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 雌性去卵巢骨质疏松大鼠模型制备、分组及给药

切除大鼠双侧卵巢建立雌性去卵巢骨质疏松大鼠模型。术前12 h禁食不禁水,称定体质量后,于腹腔注射麻醉,备皮,消毒,沿腹中线做2 cm～3 cm的切口打开下腹部,暴露腹腔后找到子宫,沿子宫向上探寻可见卵巢,摘除卵巢构建雌性去卵巢骨质疏松大鼠模型[1]。术后注射(肌肉)青霉素,连续3 d,预防术后感染。术后第5 d对模型大鼠进行阴道涂片,每天1次,连续5 d,若不出现动情期反应则表示造模成功。此外,另有部分大鼠术中只摘取卵巢附近的少许脂肪组织,不摘除卵巢,并在5 d后进行阴道涂片。

术后大鼠适应性喂养1 w,随机选取12只摘取脂肪组织的大鼠作为假手术组(Sham组),将去卵巢骨质疏松模型大鼠随机分为模型组(OVX组,n=12)、雌二醇组(E2组,n=12)、藏药二十五味鬼臼丸组(GJW组,n=12)。术后2 w开始灌胃给药,E2组予戊酸雌二醇(0.1 mg·kg-1),GJW组予藏药二十五味鬼臼丸(800 mg·kg-1),OVX、Sham组予同体积的生理盐水,连续灌胃12 w,每日1次。

1.2.2 大鼠体质量监测

灌胃期间,每周称取大鼠体质量并记录。

1.2.3 样本制备

末次给药后,大鼠禁食12 h,深度麻醉后,于腹主动脉取血离心(4℃、3 000 r/min、15 min),血清保存于-80℃冰箱。分离出大鼠的双侧股骨,去除左侧骨组织周围的肌肉和韧带置冻存管,保存于-80℃冰箱,去除右侧骨组织周围的肌肉和韧带放入4%多聚甲醛固定。

1.2.4 骨代谢相关生化、血清学指标检测

末次给药后,于大鼠腹主动脉取血离心(4℃、3 000 r/min、15 min),血清保存于-80℃冰箱。采用ELISA法检测血清OC、TRAP5b、Ca和E2、LH含量。

1.2.5 骨生物力学检测

将大鼠左侧股骨放在万能材料力学试验机检测,测试时将样本放置在两个支撑横杆处,载荷加载棒位于骨组织中央,每组样品以匀速加载,直至样品骨组织断裂。检测过程中实时记录骨组织的相关指标并绘制载荷-变形曲线,测得最大载荷、位移。

1.2.6 TRAP染色

将右侧股骨分离固定在4%多聚甲醛中48 h,然后在pH为7.2的10%乙二胺四乙酸(EDTA)中脱钙,持续10 w。然后将每个骨标本冠状面切割成4 μm厚的切片,在梯级乙醇溶液(80%、90%、95%、100%)中脱水,并包埋于石蜡中,将组织固定在普通玻片上,对切片(4 μm)进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,用TRAP/ALP染色试剂盒标记破骨细胞。染色后从每个层面随机选择股骨远端干骺端视野拍照。

1.2.7 电镜扫描

将制备好的样品放置在样品台后做真空处理,打开钨丝灯,分别在 30、500、3 000的放大倍数下观察股骨的骨小梁数目和排列情况,以及骨小梁表面的胶原纤维排列及走向情况。

1.2.8 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠骨代谢相关生化指标变化和血清激素水平变化(表1)

表1 大鼠骨代谢相关生化和血清激素水平

2.2 大鼠骨生物力学水平变化(表2)

表2 大鼠骨生物力学水平

2.3 大鼠股骨破骨细胞的变化(图1,表3)

图1 大鼠股骨破骨细胞染色图(TRAP,200×)

表3 大鼠破骨细胞染色面积

破骨细胞前体TRAP染色呈阳性,Sham组的TRAP呈弱阳性,OVX组的TRAP呈强阳性,E2组与GJW组的呈弱阳性。在股骨骺线附近测量TRAP阳性占比面积,与Sham组比较,OVX组大鼠股骨阳性面积显著增大(P<0.05);与OVX组比较,E2组大鼠股骨阳性面积显著减小(P<0.05),GJW组大鼠股骨阳性面积显著减小(P<0.05)。

2.4 大鼠股骨超微结构变化(图 2)

在低倍镜下观察大鼠的骨小梁数目及排列情况,在高倍镜下观察骨小梁表面以及骨胶原纤维的排列情况。低倍镜下,与Sham组相比,OVX组骨小梁的立体网状结构疏松,骨小梁变细且有裂痕,部分直接断裂,骨吸收孔大小形状不均衡;E2组骨小梁排列紧密,间距小,骨小梁粗细均匀、根根相连,立体网状结构完整,骨吸收孔较小;GJW组骨立体网状结构部分恢复,骨小梁排列相对紧密,有部分裂痕,基本没有断裂面,吸收孔较小。在高倍镜下,与Sham相比,OVX组骨小梁表面多凹凸不平,出现虫蚀样改变,骨胶原纤维排列杂乱;E2组骨小梁表面较为平整,骨胶原纤维走向规则;GJW组骨小梁表面有虫蚀样改变但相对较少,骨胶原纤维走向趋于整齐。

3 讨论

中医认为绝经后骨质疏松症与肝气衰竭、肾气不足密切相关,《黄帝内经》指出若肾气亏虚、脏腑虚弱会致全身血运不畅,无法滋养全身筋骨,导致骨病发生。绝经期妇女肝肾易虚且雌激素水平逐渐下降,因此预防和治疗绝经后骨质疏松症需要护肝肾、同时补充雌激素。激素替代疗法(HRT)极大地改善了这些状况,然而长期使用HRT使乳腺癌、子宫内膜癌和中风等疾病的风险增加[2]。补充副作用小的植物雌激素更易被人们所接受[3,4]。近年来,藏药防治骨质疏松的研究日益增多,郜靓[5]用复方牦牛骨粉对用维甲酸诱导的骨质疏松症进行治疗,发现其可增加Ca2+浓度和骨形成,使大鼠骨密度增加,骨量丢失明显改善。雌性去卵巢骨质疏松大鼠用藏药护骨十五丸治疗时可增加骨小梁面积与骨皮质指数比,增加骨钙含量,提高股骨最大变形能力[6]。旺久[7]等人在骨质疏松性骨折(OPF)动物模型中给予藏药合剂珊瑚接骨丸能够改善OPF大鼠骨折处骨组织形态学,提高其骨密度及愈合后的骨生物力学特性。

众所周知,雌激素的流失是女性骨质流失的关键驱动因素,在某种程度上是男性骨质流失的关键驱动因素。在绝经后骨质疏松症的发生过程中,女性体内的激素E2会下降,LH会反馈性上升[8,9]。激素水平的改变导致股骨骨密度的降低和股骨干骺端骨微结构的破坏[10],在本实验中,检测大鼠体内的雌激素水平和骨重塑标志物后发现,TRAP5b、OC、Ca发生不同程度的改变,体内雌激素水平降低时,OC、Ca水平降低,TRAP5b水平升高,而给予GJW后,以上指标会得到一定程度的改善。破骨细胞是一种大型多核细胞,具有造血功能,负责吸收骨基质,并由成骨细胞和成骨细胞分泌的细胞外信号调节[11],雌激素可以促进间充质干细胞(MSCs)的骨生成分化和成骨细胞成熟,从而促进骨形成;除此之外,雌激素会抑制破骨细胞的形成,并诱发破骨细胞凋亡,这限制了骨的吸收,当女性体内的雌激素不足时,这些骨同化和抗骨碎屑作用会降低,导致持续的骨骼破坏[12]。本实验对股骨的干骺端进行TRAP染色时,雌性去卵巢骨质疏松大鼠的破骨细胞数明显上升,经GJW治疗后破骨细胞数目趋近正常水平,使骨吸收和骨形成处于动态平衡,有效改善了雌性去卵巢骨质疏松大鼠的症状。骨生物力学研究解释多尺度骨结构如何抵抗裂纹起始韧性和裂纹生长韧性时认为,骨骼复杂的多尺度结构是其机械行为的基础,骨骼结构通过骨化过程产生,并通过骨代谢过程进行维持[13]。基于生物力学我们发现,GJW能显著增加雌性去卵巢骨质疏松大鼠的骨抗压缩、抗拉伸能力。骨头在最小长度的尺度上通过变形来抵抗裂缝的启动,当骨骼在负荷下变形时,微裂纹的积累可以延伸到骨基质的有机部分,改变骨矿化胶原纤维的走向,胶原纤维根据特定的应变模式对齐,并具有不同的机械功能,使得骨骼能够通过强大的抗骨折机制来承受复杂的生理负荷[14,15]。ANNA SHIPOV等发现[16],OVX大鼠的骨空隙在片状区域和杂乱无章区域都明显变小,OVX大鼠的这些形态变化可能会损害细胞间的通信,影响骨细胞-导管系统的功能,从而降低骨细胞在机械传感和损伤修复中的有效性。本实验采用电镜观察骨质的细微表面发现,OVX大鼠的骨小梁结构及骨胶原纤维的改变与其研究结果一致,绝经后雌激素缺乏对小梁骨和皮质骨都有显著影响,在骨质疏松症中起着至关重要的作用。GJW明显逆转雌激素缺乏带来的骨质破坏,改善骨代谢失衡导致的骨组织骨微结构改变,可能与此有关。

综上所述,藏药二十五味鬼臼丸可通过调节骨转换标志物,抑制破骨细胞形成,调节骨代谢平衡,显著改善雌性去卵巢骨质疏松大鼠的骨密度和骨超微结构。但本研究还存在一些局限性:(1)仅从血清代谢水平分析了藏药二十五味鬼臼丸对雌性去卵巢骨质疏松大鼠的骨代谢指标和性激素水平的影响。Labrie等人[17,18]发现,老年男性的血清雌二醇水平高于绝经后女性,雄激素和雌二醇循环水平的改变已被证明与低骨量和骨强度受损有关。男性ER-a的突变导致其产生雌激素抗性,从而引起骨质疏松,骨小梁和皮质骨密度降低,骨转移标志物增加,骨骺难以融合附体[19]。因此,藏药二十五味鬼臼丸是否对雄性去睾丸大鼠的骨代谢指标和性激素水平有相似的影响还需进一步验证。(2)本研究中,与骨代谢相关信号通路中的代谢蛋白及基因尚待进一步检测分析。骨代谢的动态平衡在维持正常骨组织功能方面发挥着重要作用。当平衡被打破时,会出现骨质疏松症等骨代谢疾病。骨代谢过程受许多信号通路调节,包括Wnt、Notch、Hedgehog通路和OPG/RANKL/RANK通路等,每个信号通路之间相互影响,参与骨骼发育和新陈代谢,与骨髓间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的分化和增殖密切相关[20]。基于各个信号通路在骨代谢中的作用,越来越多的研究人员关注骨质疏松症的发病机制,并通过抑制或激活该信号通路来开发治疗骨质疏松症的药物。然而,信号通路的复杂性致其作用机制不清。抑制信号通路的拮抗剂在临床上的使用是有限的,因此,深入探索骨代谢与药物共同作用途径在骨代谢中的机制及其与其他信号途径的关系,将为预防和治疗骨质疏松症提供新方法。