不同年龄段健康人结膜囊菌群分布及抗生素敏感性分析△

梁 倩 夏 甜 荆丽丽 元 静 黄钰森

眼内炎是一种极其严重的眼部感染性疾病,常见于白内障手术、眼外伤或玻璃体内注射后[1]。据调查,白内障术后眼内炎发生率为0.03%～0.20%,在全球范围内进行的大量白内障手术中每年有数千例患者发生眼内炎[2]。因为眼内炎的难治性及可能出现的严重后果,早期的预防显得格外重要。Speaker等[3]研究认为,眼内炎致病微生物80%来源于术眼结膜囊的正常共生菌群。结膜囊菌群中表皮葡萄球菌是最主要菌种,并且在世界各地似乎都是如此[4-6]。许多眼外科医师通过在术前或围手术期对结膜囊使用抗生素来降低眼内炎出现的风险。但由于环境、人种及用药习惯等不同,各地对抗生素的选择也不尽相同[7-8]。因此,有必要定期进行当地的菌群及抗生素敏感情况分析,优化使用抗生素,从而更好地指导临床的预防性用药。老年人为进行白内障手术的主要群体而被广泛关注。相比之下,其他年龄段人群的结膜囊菌群分布情况却鲜见报道。我们在排除了感染性眼部疾病的情况下,回顾性地对不同年龄段人群结膜囊分泌物的细菌培养及抗生素敏感性结果进行了描述,以期了解各年龄段健康人群的结膜囊菌群分布特征及抗生素敏感情况,为眼科预防性用药和相关感染性疾病的有效治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

对2018年至2021年山东第一医科大学附属青岛眼科医院1 131例(1 839眼)患者的结膜囊细菌分离株的记录进行了回顾性审查。临床样本取自就诊的经详细眼部及全身检查无眼部感染或眼部充血、红肿等症状的健康人群,主要是择期行斜视矫正手术、角膜屈光手术或白内障手术的患者,同时近1个月来全身或局部使用抗生素或合并已知的系统性疾病或免疫缺陷性疾病的患者排除在外。研究人群中男女比例1.171.00,年龄1个月～91岁(中位数11.00岁,四分位数5.00岁、40.00岁)。根据人民卫生出版社第9版《儿科学》和《协和老年医学》按患者年龄分为4组:儿童组(≤18岁)580例、青年组(>18～45岁)134例、中年组(>45～65岁)155例和老年组(>65岁)262例。本研究遵循《赫尔辛基宣言》原则,并通过山东第一医科大学附属青岛眼科医院伦理委员会批准[伦审号:(2021)05],患者均签署知情同意书。

1.2 方法

取样时眼表滴用5 g·L-1丙美卡因滴眼液行结膜麻醉,消毒棉拭子用无菌生理盐水润湿后轻轻按揉,从结膜穹隆内侧到外侧收集样本,取样过程需注意不能接触睑缘和确保患者不眨眼。取材拭子在血琼脂培养基(比克曼生物科技有限公司)上接种后,将培养基放入37 ℃培养箱,至少24 h观察一次,48 h未见细菌生长为阴性。所有培养阳性的细菌根据美国临床实验室标准化研究所(CLSI)标准在我院临床微生物学实验室使用美国德灵公司的自动化微生物学系统(Microscan Walkaway 96)进行细菌鉴定和抗生素敏感性实验。本研究仅包括经过抗生素敏感性实验的非重复分离株,并非所有抗生素都针对每种分离株进行了测试。数据来源于临床微生物学实验室使用的实验室信息系统。对于阳性结果,除了样本提交日期、分离的细菌以及对各种抗生素的敏感性外,还记录了患者姓名、住院号、年龄、性别和采集地点等。

1.3 统计学方法

使用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用χ2检验或Fisher确切概率检验分别比较不同年龄段人群间结膜囊菌群分布及抗生素敏感性的差异,两两比较采用Bonferroni法进行。检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 不同年龄段人群结膜囊细菌检出情况

1 839份不同年龄段人群结膜囊分泌物中有 1 194份样本有细菌生长,共分离出1197株细菌,其中3份样本同时分离出2种细菌,细菌总检出率为64.93%。不同年龄组及性别的结膜囊细菌检出情况见表1。其中,青年组男性细菌检出率高于女性,差异有统计学意义(P=0.001)。男性细菌总检出率为66.53%,与女性的63.05%相比差异无统计学意义(P=0.118)。不同年龄组间细菌检出率总体差异有统计学意义(χ2=182.350,P<0.001),进一步两两比较发现,儿童组的细菌检出率(76.79%)明显高于青年组的48.08%、中年组的42.35%和老年组的46.43%(χ2=85.376、87.484、99.981,均为P<0.001),青年组、中年组以及老年组间两两相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

2.2 不同年龄段人群结膜囊细菌分离株情况

不同年龄段人群结膜囊细菌分离株情况见表2。总体而言,结膜囊细菌主要以革兰阳性球菌为主,占89.56%,其中表皮葡萄球菌(55.97%)、金黄色葡萄球菌(8.60%)、缓症链球菌(7.52%)是最常见的细菌;革兰阳性杆菌中棒杆菌属占大多数(5.93%),革兰阴性杆菌的常见菌为不动杆菌属(1.00%),极少见到革兰阴性球菌(0.08%)。表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、缓症链球菌、粪肠球菌、摩氏摩根菌、其他肠杆菌和棒杆菌属在不同年龄组间的差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。两两比较结果显示,表皮葡萄球菌在青年组中占比76.80%高于其他3组(χ2=25.148、8.504、13.002,均为P<0.01),其在儿童组、中年组和老年组间的占比两两相比差异均无统计学意义(均为P>0.05);金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌占比在不同年龄组间虽然总体相比差异均有统计学意义,但组间两两相比差异均无统计学意义(均为P>0.05);儿童组的缓症链球菌占比 9.08% 高于青年组的1.60%(χ2=8.179,P=0.004),其余组间两两相比差异均无统计学意义(均为P>0.05);儿童组与老年组间粪肠球菌占比差异有统计学意义(χ2=23.261,P<0.001),老年组为6.15%高于儿童组的0.57%,其余组间两两相比差异均无统计学意义(均为P>0.05);相比于儿童组,摩氏摩根菌在老年组中更多见(Fisher确切概率P<0.001);而在棒杆菌属中青年组占比12.80%明显高于儿童组的5.52%(χ2=9.632,P=0.002)和老年组的2.31%(χ2=10.173,P=0.001),其余组间两两相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

表2 不同年龄段人群结膜囊细菌分离株 [眼数(%)]

2.3 不同革兰染色菌对抗生素的敏感性分析

共1 153株革兰阳性菌进行了抗生素敏感性实验,结果见表3。革兰阳性菌对青霉素类、大环内酯类抗生素大多耐药。青霉素、氨苄西林、红霉素和阿奇霉素的敏感率分别为24.82%、16.79%、20.87%、17.21%。达托霉素针对965株革兰阳性菌进行了实验,敏感率高达99.90%,居首位,其次是万古霉素的99.56%和利奈唑胺的99.20%。此外,氟喹诺酮类抗生素,例如加替沙星(98.57%)和莫西沙星(97.09%)也具有较高的敏感率。

表3 结膜囊革兰阳性菌的抗生素敏感性

44株革兰阴性菌的抗生素敏感性实验结果见表4。结果显示,革兰阴性菌对头孢菌类抗生素的敏感率较低(41.38%～80.00%),其中头孢他啶的敏感率为79.55%,而对氨基糖苷类阿米卡星(90.48%),氟喹诺酮类环丙沙星(90.91%)、加替沙星(93.94%)、左氧氟沙星(97.62%)和氧氟沙星(97.73%)敏感。

表4 结膜囊革兰阴性菌的抗生素敏感性

2.4 眼科常见抗生素的敏感性分析

进一步分析不同年龄组及革兰染色菌对眼科常见抗生素滴眼液的敏感性,结果见表5。结果显示,不同年龄段人群对利福平的敏感率相似(P=0.131),除此以外,不同年龄段人群间对其他抗生素的敏感率均有不同,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。两两比较结果显示,儿童组对夫西地酸的敏感率最差,为54.55%,与其他3组相比,差异均有统计学意义(均为P<0.001)。除加替沙星外,不同革兰染色菌对抗生素的敏感率也不同,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。革兰阴性菌对阿奇霉素的敏感率达52.27%,而革兰阳性菌却只有17.21%(P=0.000);革兰阳性菌对夫西地酸的敏感率为63.37%,而革兰阴性菌为21.62%(P=0.000)。左氧氟沙星的总敏感率为79.76%,其中革兰阳性菌为79.11%,而革兰阴性菌达97.62%(P=0.003)。但加替沙星无论是在不同年龄段人群还是在不同革兰染色菌中,敏感率均超过90%,总敏感率高达98.44%,高于环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、妥布霉素、红霉素、阿奇霉素、利福平和夫西地酸,差异均有统计学意义(均为P<0.001)。

表5 眼科常见抗生素滴眼液的敏感性 [%(眼数比)]

3 讨论

本研究分析了2018年至2021年间来自山东第一医科大学附属青岛眼科医院1 131例(1 839眼)不同年龄段健康人群结膜囊的1 197株细菌分离株。细菌总检出率为64.93%,与黄钰森等[9]2009年报道的白内障患者术前结膜囊细菌检出率66.7%相似,处于其他文献报道36.0%～81.7%[10-12]的中上区间。检出率的变化可能是由不同的人群、检测方法和研究环境不同造成的。各年龄分组中儿童组结膜囊细菌检出率(76.79%)最高,同样在王娟等[13]的样本中,0～6岁年龄段患者的结膜囊细菌检出率高于其他年龄段。这说明年龄是影响细菌检出的因素之一,不同年龄间的差异可能与免疫力、泪液成分、泪液动力学、暴露环境、抗生素使用情况、皮肤和上呼吸道菌落的不同等有关[14]。以往研究显示,老年人有较高的结膜囊细菌检出率[4,15]。本研究中,儿童结膜囊细菌的高检出率,提示我们在临床中不仅需要对高龄人群的围手术期给予更有针对性的预防措施,同时也要给儿童更多关注,以降低术后感染相关疾病的发生。

本研究结果显示,结膜囊细菌分离株主要是革兰阳性菌,大多数是表皮葡萄球菌(55.97%),其次是金黄色葡萄球菌(8.60%)、缓症链球菌(7.52%)和棒杆菌属(5.93%)。这一发现与美国[16]、澳大利亚[17]和英国[18]的研究结果相似,表皮葡萄球菌已成为首要致病菌[12]。此外,相较于青年组(1.60%),儿童组(9.08%)有更多的缓症链球菌。Ke等[19]研究表明,链球菌属不仅常见于口腔,也常见于结膜囊,尤其是6岁以下的儿童达到21.4%。而青年组中棒杆菌属较高的占比(12.80%),我们推测可能与青年人在临床中细菌性角膜溃疡的低发病率有关。St Leger等[20]研究发现,生活在结膜上的棒状杆菌可以调节局部黏膜免疫,促使中性粒细胞募集和抗菌药物释放到泪液中,从而保护眼睛免受病原体感染。

本研究中,革兰阳性菌对青霉素类(16.79%～53.47%)、大环内酯类(17.21%～20.87%)抗生素大多耐药,对万古霉素(99.56%)和加替沙星(98.57%)具有较高的敏感率。革兰阳性菌的耐药性多项研究都有报道但结果不尽相同。牛梅民等[21]对205份白内障患者术前结膜囊样本的抗生素敏感性试验结果显示,革兰阳性菌对氨苄西林、青霉素、苯唑西林、红霉素的敏感率分别为8%、20%、28%和40%,与本研究结果一致;但在王娟等[13]的研究中,健康人结膜囊细菌不仅对青霉素、苯唑西林、大环内酯类抗生素等敏感率较低,为1.87%～21.71%,对氟喹诺酮类抗生素也呈中度敏感,敏感率为45.49%～55.43%,远低于本研究的71.90%～98.57%。尽管如此,对万古霉素却始终保持着较高的敏感率,这支持我们将其用于革兰阳性菌感染的全身性治疗。对于革兰阴性菌,相较于头孢菌类抗生素的低敏感率(41.38%～80.00%),氨基糖苷类的阿米卡星和氟喹诺酮类抗生素的敏感率均超过90%。在美国[22],革兰阴性菌对头孢他啶和阿米卡星有高敏感率,为89.5%～100.0%;但在印度[23-24],革兰阴性菌对头孢他啶(61%～63%)、阿米卡星(68%～82%)和环丙沙星(73%～87%)的敏感率与本研究结果相似。我们推测抗生素的广泛使用以及革兰阴性菌之间多药耐药性的交叉转移是差异产生的可能原因[25]。

抗生素敏感性差异不但表现在不同革兰染色菌之间,还存在于不同年龄组间。本研究中,阿奇霉素的总敏感率低至18.50%,其中革兰阳性菌的敏感率为17.21%,而革兰阴性菌的敏感率为52.27%,明显高于革兰阳性菌。夫西地酸的总敏感率为62.05%,其中革兰阳性菌的敏感率为63.37%,而革兰阴性菌仅为21.62%,明显低于革兰阳性菌,这与Gao等[26]报道的结果一致。夫西地酸一直是经验性抗葡萄球菌治疗的常见选择,儿童组对夫西地酸的低敏感率(54.55%),可能是由于夫西地酸的广泛使用导致耐夫西地酸的金黄色葡萄球菌增加造成的。在挪威儿童中,金黄色葡萄球菌对夫西地酸的耐药率已从1992年的3%上升到2001年的36%[27];希腊中部一项为期7年的研究显示,儿童耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对夫西地酸的耐药率更是达到了88.9%[28]。这些研究结果提醒我们,进一步对人群或者菌种进行分类将在统计分析抗生素敏感性时产生更准确的结果,从而可以在需要时选择敏感性更高的抗生素以获得更好的治疗效果。

围手术期预防性用药对于预防术后眼内炎的发生具有重要意义。以白内障手术为例,欧洲推荐术毕前房内注射莫西沙星、万古霉素、头孢呋辛等抗生素,而美国和中国则推荐将氟喹诺酮类广谱抗菌滴眼液作为白内障术前预防眼内炎的重要措施[7-8]。在我院,加替沙星成为首选抗生素。尽管多年来,左氧氟沙星常被推荐,但本研究结果表明,结膜囊细菌分离株对它的敏感率较低 (79.76%),远不及加替沙星的98.44%。这一结果与Gentile等[29]和Gao等[26]的报道相一致。左氧氟沙星敏感率的下降表明它可能不再适用于眼科手术前的预防。相反,高敏性的加替沙星是一种8-甲氧基氟喹诺酮类抗生素,因其对许多革兰阳性和革兰阴性病原体、非典型微生物和一些厌氧菌都显示出良好活性,目前已被广泛应用于各系统疾病中。

4 结论

表皮葡萄球菌是各年龄段健康人群结膜囊最常见的细菌;加替沙星无论是在不同年龄段人群还是在不同革兰染色菌中均普遍敏感,仍然是眼科围手术期的优秀经验性抗生素;抗生素在不同年龄段人群及革兰染色菌敏感性的差异鼓励我们对当地菌群分布特征及抗生素敏感性情况进行定期审查,以便能够使用最合适的抗生素预防和治疗感染。本研究的回顾性和研究时间的限制决定了我们的样本量以及不同年份间各年龄段样本的构成比例,最终限制了我们对结膜囊细菌检出率的年变化、菌群分布情况和抗生素敏感性变化趋势的分析。以后仍需进行更大样本量、更长时间的前瞻性研究以调查不同年龄段人群结膜囊菌群分布特征及抗生素敏感性情况。