CypD介导mPTP在褪黑素改善七氟醚重复暴露致认知损伤中的作用

邹雪竹,张晓媛,张 丽

(1. 安徽医科大学第二附属医院麻醉与围术期医学科,2. 麻醉与围术期医学安徽普通高校重点实验室,安徽 合肥 230601)

在美国食品药品监督管理局(FDA)发布的一份有关药物安全建议的声明中提到:对于3岁以下婴幼儿或孕妇来说,在外科手术或其他医疗方式中长期使用全身麻醉药会增加大脑发育受损的风险[1]。临床也进行了很多相关性的研究,其中一项回顾性病例分析发现,儿童在幼龄期多次或长时间接受全身麻醉会造成大脑结构的改变和认知功能的缺陷,增加日后发生学习障碍的风险[2]。七氟醚具有无创、血流动力学稳定、术后苏醒快等独特的优势,已成为小儿手术中最常使用的吸入性麻醉剂[3]。同时,七氟醚对发育中大脑的损伤作用也引起了大家的关注。越来越多的基础实验研究表明,大脑在发育时期重复或长时间暴露七氟醚会对神经发育产生影响,并且在成年后可能出现认知功能障碍[2]。Zhang等[4]研究发现,七氟醚可以通过上调幼鼠海马组织中亲环素D(cyclophilin D,CypD)的表达,引起线粒体功能障碍和神经损伤,最终造成小鼠的认知功能损伤。

近年的临床研究发现,褪黑素可能具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多种作用,并且被证实可以在各种病理状态下发挥神经保护作用。例如,褪黑素被用于缓解新生儿和儿童静脉穿刺镇痛的同时,可以减少或代替其他镇静剂的用量;其还可作为儿科患者麻醉诱导前的辅助用药[5]。动物实验也证明了褪黑素预处理可以通过介导MT-1受体和Wnt信号之间的相互作用,对幼龄小鼠暴露七氟醚后引起的突触毒性、髓鞘异常和记忆损伤产生积极的影响[6]。然而,褪黑素是否可以通过下调CypD介导线粒体通透性转化孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的开放,进而减轻神经元突触损伤及改善认知功能障碍,尚不清楚。因此,本实验以此为切入点,探索褪黑素改善七氟醚引起发育期神经损伤的可能机制。

1 材料

1.1 实验动物8周龄C57BL/6J SPF级小鼠(♀9只,♂6只),购自河南斯克贝斯生物科技有限公司,生产合格证书编号:SCXK(豫)2020-0005。小鼠饲养于安徽医科大学第二附属医院实验动物中心,温度保持在(24±1)℃,湿度为45%～55%,可自由获取充足的食物和水。新生小鼠在此实验动物中心进行繁殖,动物实验已经实验动物伦理委员会批准,伦理号:LLSC20221125。

1.2 主要试剂七氟醚(22090931),购自上海恒瑞医药有限公司;组织线粒体分离试剂盒(C3606)、JC-1膜电位检测试剂盒(C2006),均购自北京碧云天生物科技有限公司;动物蛋白提取试剂盒(C510003),购自生工生物工程(上海)有限公司;Omni-EasyTM一步法PAGE快速凝胶制备试剂盒(PG212)、Omni-FlashTM无冰浴快速转膜液(PS201S)、无蛋白快速封闭液(PS108),均购自上海雅酶生物医药科技有限公司;褪黑素(M5250)、Synapsin-1(#3050)抗体,购自美国Sigma-Aldrich公司;抗CypD(ab110324)、PSD95(ab76115)抗体,购自Abcam公司;GAPDH(6004-1-Ig)抗体,购自武汉Proteintech公司。

1.3 主要仪器Varios Ran LUX型多功能微孔板酶标仪(美国赛默飞世尔科技有限公司);543OR型低温高速离心机(德国艾本德生命科学公司);UVP型凝胶成像仪(德国Analytik Jena公司);七氟醚挥发罐(德国德尔格公司);气体浓度监测仪(深圳迈瑞生物医疗电子有限公司);Vert.A1型荧光倒置显微镜(德国蔡司公司);Morris水迷宫(淮北正华生物仪器设备有限公司)。

2 方法

2.1 模型构建及实验分组6日龄小鼠随机分为3组,每组11只:①对照组(Con)每日腹腔注射1%乙醇0.5 h后,吸入30%氧气混合70%空气2 h;②七氟醚组(Sevo)每日腹腔注射1%乙醇0.5 h后,吸入3%七氟醚(由30%氧气和70%空气的混合气代入)2 h;③褪黑素预处理+七氟醚组(Sevo+Mel)腹腔注射褪黑素(溶解于无水乙醇,10 mg·kg-1)0.5 h后,吸入3%七氟醚2 h;连续3 d。暴露七氟醚过程中进行浓度监测,并且使用保温垫保温,以免小鼠在麻醉状态下体温过低,降低死亡率。9只小鼠在实验结束(8日龄)麻醉后断头分离海马组织,用于提取线粒体;24只小鼠在第30～40日龄时进行行为学实验,实验结束后分离小鼠海马,提取蛋白质。

2.2 线粒体膜电位检测小鼠在8日龄造模结束后直接断头取脑,在冰上分离海马组织,按重量在研磨管中加入线粒体分离试剂A,冰浴研磨,将匀浆高速离心2次,去除上清液,分离得到的沉淀即为线粒体,再将线粒体储存液加入到线粒体中重悬。使用线粒体膜电位检测盒中提供的试剂进行JC-1染色工作液的配制,将0.9 mL稀释后的JC-1染色工作液与0.1 mL未经冷冻的线粒体重悬液加入到6孔板中,混匀,马上在倒置荧光显微镜下观察、拍照,荧光强度使用ImageJ软件分析。

2.3 新物体识别实验用于评估动物对新奇事物的学习和记忆能力,实验用箱大小为40 cm×40 cm×40 cm。造模小鼠在第30日龄时进行实验,分为3个阶段:①适应阶段,将小鼠放置在没有任何物体的箱子内5 min,以适应实验环境,每天2次,连续适应3 d;②熟悉阶段,将两个相同的物体(F1和F2)放置在箱子中离侧壁10 cm的位置,从物体的反方向放入小鼠,让其自由运动10 min熟悉物体,并记录在箱内的移动轨迹;③测试阶段,熟悉阶段结束后24 h,用1个新的物体(N)替代其中1个物体(F2),并让小鼠在实验箱内自由探索5 min,记录运动轨迹。每次测试结束后,使用75%乙醇清除味道以免对小鼠产生干扰。使用动物行为分析软件(Smart 3.0)记录小鼠分别对新物体和旧物体的探索时间,按照嗅探新物体时间与总时间的比值计算新物体识别指数。

2.4 Morris水迷宫主要用于分析动物的空间记忆能力。泳池直径为80 cm,被平均分为4个象限,平台放置于任一象限,水位线位于平台上方约1 cm处。小鼠在第35日龄时进行实验,首先为练习阶段,将小鼠分别从泳池的4个象限放入,将小鼠寻找平台的时间称为逃逸潜伏期,如果60 s内未发现目标,则引导至平台处,此时逃逸潜伏期为60 s,每天训练4次,连续5 d。24 h后,进行实验阶段,取出平台,在平台所在象限的对面象限放入小鼠,记录小鼠在60 s内穿越平台所在象限的次数及平台所在象限内的运动时间和路程[7]。

2.5 蛋白质印迹行为学实验完成后的d 2,小鼠在麻醉状态下断头取脑,于冰上分离海马组织,将配好的蛋白裂解液(包含蛋白酶抑制剂)加入到组织中,60 Hz研磨45 s,将匀浆在冰上静置10 min后,高速离心机4 ℃离心,获得的上清液即为总蛋白,使用BCA法检测蛋白浓度。再将蛋白与上样缓冲液充分混合,变性,保存于-20 ℃。取蛋白样品置于冰上,用一步法快速凝胶进行电泳分离,按所需目的蛋白的分子量大小进行转膜,使用快速封闭液封闭15 min,TBST洗涤后,加入1 ∶1 000稀释的一抗(CypD、Synapsin-1、PSD95)4 ℃摇床孵育过夜。一抗孵育结束后,与相同种属来源的二抗在室温孵育1 h,使用凝胶成像仪化学发光法进行条带显影,ImageJ软件分析条带灰度值。

3 结果

3.1 褪黑素对七氟醚引起的学习记忆障碍的改善作用新物体识别实验结果表明(Fig 1),与对照组相比,七氟醚组小鼠的记忆能力下降,未认出熟悉物体,花费更多时间探索旧物体,较少时间探索新物体,新物体识别指数明显下降(P<0.01);而褪黑素预处理组的小鼠对熟悉物体具有一定的记忆,偏好新奇性的天性使小鼠对新物体更感兴趣,探索时间明显增加,对熟悉物体探索时间减少,新物体识别指数升高,证明褪黑素对学习记忆能力具有改善作用(P<0.01)。

3.2 褪黑素对七氟醚引起的空间记忆障碍的改善作用Morris水迷宫实验结果显示(Fig 2),与对照组相比,七氟醚组小鼠的逃逸潜伏期明显延长,而在平台所在象限内穿越平台次数、运动时间和路程均明显下降(P<0.05);与七氟醚组相比,褪黑素预处理组的小鼠在训练第3天时,逃逸潜伏期开始下降,在第4天和第5天时下降更明显,同时小鼠穿越平台次数、在平台所在象限内运动的时间和距离均明显增加。

3.3 褪黑素升高海马神经元线粒体膜电位如Fig 3所示,与对照组比较,七氟醚组小鼠海马神经元线粒体中,JC-1聚合物与JC-1单体荧光比值降低(P<0.01),说明线粒体膜电位下降;与七氟醚组比较,褪黑素预处理组的线粒体膜电位明显升高(P<0.01)。

3.4 褪黑素及七氟醚对突触蛋白、CypD表达的影响如Fig 4所示,与对照组相比,七氟醚组Synapsin-1、PSD95突触蛋白表达下降(P<0.01),CypD表达上调(P<0.05);与七氟醚组相比,褪黑素预处理组Synapsin-1、PSD95突触蛋白表达均上调(P<0.05),CypD表达下降(P<0.01)。

Fig 2 Morris water n=8)

4 讨论

七氟醚作为儿童全身麻醉中最常见的吸入麻醉药,已被证实,在婴幼儿时期大量使用会影响神经发育及以后的认知功能[8]。人类神经系统发育关键期是妊娠晚期和婴儿期,对于啮齿类动物来说,神经发育关键期是出生后2周内,因此,麻醉剂的干扰在这个时间段表现最为显著和持久[9]。美国麻醉临床结果登记处(NACOR)数据库显示,临床上大多数儿童麻醉时间低于3 h,但对于病情较重的患儿,麻醉时间可能会大于3 h[10]。3%的浓度是儿科手术中最常用到的七氟醚浓度[11],因此我们模拟了临床上常用的七氟醚浓度,增加暴露时间和次数建立模型。

褪黑素作为氧化和凋亡信号的内源性调节剂,具有神经保护作用,能够维持线粒体稳态。研究发现,褪黑素可以通过受体依赖性途径改变Ca2+/CaMKⅡ活性,加速受损神经元的细胞骨架重塑[12]。褪黑素也能通过增加NMDA受体浓度、Ca2+/CaMKⅡ和脑源性神经营养因子蛋白水平,调节钙稳态,改善记忆和认知缺陷[13]。临床上,因其具有催眠、镇痛、抗惊厥等特点,被用于术前镇静剂和麻醉剂的结合[14]。鉴于目前所知的褪黑素副作用较少,我们将褪黑素用于提高七氟醚麻醉的安全性。

新物体识别实验是根据动物具有接触与探索新鲜事物的喜好,用于检测其学习记忆能力;Morris水迷宫可以很好地反映动物在空间方面的记忆和学习能力;两种方法的结合可以客观评价小鼠的学习和记忆能力[15]。为了观察褪黑素对七氟醚损伤远期认知功能的改善作用,我们进行了新物体识别和Morris水迷宫实验。行为学实验结果显示,小鼠在幼年时期接受大量七氟醚暴露,在其成年后会出现新物体和空间学习记忆障碍,经褪黑素预处理的幼鼠,其成年后在新物体识别及空间记忆功能中并没有表现出明显异常,可以认为褪黑素在一定程度上有助于预防或治疗七氟醚暴露所引起的小鼠的认知缺陷。

Fig 3 Detection of mitochondrial membrane n=3)

线粒体在促进神经发育过程中起到关键作用,在突触形成的关键时期暴露全身麻醉剂将会导致线粒体融合和有丝分裂的失衡,产生过多的氧自由基,引起突触的能量代谢紊乱,对突触功能造成损害[4]。其中,CypD介导的mPTP的开放对线粒体功能具有重要调节作用。七氟醚暴露可以使小鼠海马组织中CypD的表达升高,线粒体膜电位降低,而线粒体膜电位的下降可以直接反映mPTP的开放程度[16]。本实验发现,七氟醚麻醉会导致幼龄小鼠突触蛋白表达下降及CypD表达上调,线粒体膜电位降低,说明七氟醚暴露加速了线粒体膜电位的下降,诱导了mPTP开放,损伤线粒体功能,造成神经元的凋亡。褪黑素的应用下调了CypD的表达,提高了线粒体膜电位水平,证明褪黑素可以抑制CypD,提高线粒体膜电位水平,缓解mPTP的过度开放,保护线粒体功能。

Fig 4 Expression of CypD, PSD95 and Synapsin-1

PSD95和Synapsin-1作为突触后和突触前标志物,大量研究表明其参与了突触可塑性,降低突触相关蛋白的表达可以诱导突触损伤[17]。其中,Synapsin-1更是神经元突触发育的典型标志物[18]。本实验发现,褪黑素预处理抑制了七氟醚引起的PSD95和Synapsin-1表达的减少,表明褪黑素的使用有助于改善七氟醚引起的海马突触发育障碍。

综上所述,褪黑素预处理可以改善新生动物重复暴露七氟醚后导致神经元突触损伤及认知障碍,其机制与抑制CypD的表达和mPTP的开放,促进突触蛋白的合成相关。本研究将为探索儿童麻醉和手术后认知功能障碍的潜在机制和有针对性的干预提供理论支持。