紫杉醇联合卡铂化疗对卵巢癌VEGF及肿瘤标志物表达的影响

谭树芬，杨谢兰，杨琳琳，李树清

1.昆明医科大学第三附属医院 妇科，云南 昆明 650118；2.昆明医科大学 基础医学院，云南 昆明 650050

卵巢癌(ovarian cancer,OC) 为临床常见、多发的妇科恶性肿瘤,即使在发达国家也是导致女性癌相关死亡的主要原因[1]。OC具有起病隐匿、病情进展快、早期诊断难的特征,大多数患者发现时已处于中晚期而失去手术的机会,也是OC患者预后差、病死率高的原因所在[2-3]。目前,临床肿瘤生物标志物主要包括血清糖类抗原125(serum carbohydrate antigen-125, CA-125)和人附睾蛋白4(human epididymal protein-4,HE4),但由于其敏感性和特异性有限,使得OC早期诊断及治疗仍为当前基础和临床探索的重要领域[3-4]。研究显示,OC患者血小板(platelet,PLT)可从循环中渗入肿瘤微环境,增加肿瘤细胞的增殖并促进上皮细胞向间质细胞转变[5]。然而,有关PLT与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对OC转移的影响,以及化疗对PLT和肿瘤标志物变化的研究鲜见报道。为此,本研究以发病率高、化疗敏感性强的卵巢浆液性癌(serous carcinoma,SC)为主要研究对象,从“先化疗、后手术、再化疗”的患者获取组织样本,在观察OC患者血细胞与VEGF表达变化的同时,揭示其与血清 CA-125和HE4水平改变的内在联系,探讨联合化疗对PLT、VEGF以及肿瘤标志物的影响及可能机制,为临床OC的干预评估提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料:选择2021年至2022年在昆明医科大学第三附属医院妇科行肿瘤手术患者100例。对照组年龄(41.3±11.7)岁,联合化疗组(combined chemotherapy,CC)年龄(51.2±9.4)岁;入组条件:1)无精神疾病史;2)均在本院检查确诊为原发性或复发性卵巢癌患者;3)无严重危及患者生命的合并症; 4)无化疗绝对禁忌证; 5)有完整的临床病理资料,并经本院医学伦理会审批且所有患者均签署知情同意书。

1.1.2 试剂:CA125和HE4试剂盒(Roche公司);血细胞检测试剂盒(Sysmex公司);一抗(羊抗兔)VEGF(NeoMarkers公司),羊抗兔即用型快速免疫组化二抗(福州迈新生物技术开发有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组及化疗方案:研究分为OC联合化疗CC组(n=50):病理类型包括卵巢SC Ⅰ～Ⅱ期22例、Ⅲ～Ⅳ期24例,其中低级别(G1)8例、高级别(G3)38例;卵巢黏液性癌Ⅱ期2例、卵巢透明细胞癌Ⅰ期和Ⅳ期各1例。治疗时间:CC组住院后直接实施手术治疗,术后15 ～ 30 d开始化疗并采血,化疗结束后再次采血检测患者血细胞相关指标。化疗剂量:紫杉醇+卡铂化疗,具体为紫杉醇按175 mg/m2、卡铂按AUC=5计算后静脉滴注。另取4例“先化疗、后手术、再化疗”患者的病理组织作HE和免疫组化染色。卵巢良性肿瘤对照组(n=50):病理类型包括卵巢浆液性囊腺瘤6例、卵巢黏液性囊腺瘤2例、卵巢囊肿11例、卵巢成熟性畸胎瘤27例、卵巢巧克力囊肿3例、卵巢黄体血肿1例。对照组仅实施卵巢肿瘤手术,无需化疗。

1.2.2 HE染色观察卵巢组织形态学:将OC患者的病理组织置于新配制的10%甲醛溶液固定24 h,取中间切块常规脱水、包埋,制成切片,经HE染色后在光学显微镜下观察。

1.2.3 免疫组化检测VEGF:将组织行4 μm厚度切片,常规脱蜡、水化,pH7.2～7.4磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗;用Tris-HCl抗原修复20 min,自然冷却至室温,加入一抗4 ℃过夜。次日滴加即用型快速免疫组化MaxVisionTM二抗室温下孵育30 min;PBS冲洗3次/3 min,滴加新鲜配制的DAB显色,自来水冲洗5 min终止显色;常规梯度脱水、透明、封片。用图像分析系统进行分析。VEGF阳性物为细胞质中有棕黄色细颗粒物,其表达强弱用(+)表示。结果由病理科医师独立评判后综合评定。

1.2.4 血常规的检测:所有OC患者化疗前、后采集清晨空腹平静状态下肘静脉血3 mL,沿管壁缓慢注入盛有EDTA-K2·2H2O抗凝剂的干净试管内,以保持血细胞的形态不变,并可抑制PLT聚集;同时轻轻摇动试管5～10次,用Sysmex HST-302全自动血细胞分析仪进行检测。

1.2.5 电化学发光法检测血清CA125、HE4:所有OC患者化疗前、后采集清晨空腹静脉血3 mL,3 000 r/min离心10 min,提取血清样本,于-70 ℃冰箱保存。用cobas e801全自动化学发光免疫分析仪进行检测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 联合化疗对卵巢组织病理学及VEGF表达的影响

对照组卵巢组织小血管清晰可见,上皮细胞形态正常(图1A);OC组卵巢组织结构紊乱,细胞异型明显(图1B);化疗后卵巢组织可见散在坏死细胞(图1C)。对照组正常卵巢的VEGF呈弱表达(图1D);OC组卵巢微血管内皮细胞、卵巢上皮细胞及成纤维细胞 VEGF 均呈强表达(+++)(图1E);而化疗后卵巢微血管内皮细胞、卵巢上皮细胞的VEGF 表达明显减弱(图1F) 。

HE staining showed normal ovarian cell morphology in the control group; OC has disordered tissue structure and obvious cell atypia; scattered necrotic cells were observed in SC tissue in the chemotherapy groug; IHC staining showed weak expression of VEGF in the control group, but strong expression of VEGF in OC (+++); the expression of VEGF was significantly decreased after chemotherapy

2.2 联合化疗及对照组血细胞相关指标的比较

OC患者化疗前、化疗后红细胞(red blood cell,RBC)、血红蛋白(hemoglobin,HB)、血小板(platelet,PLT)较对照组显著降低(P<0.001)(表1)。 用配对t检验对OC患者化疗前后RBC、HB和PLT的比较显示,三项指标化疗后均低于化疗前(t/z分别为11.016、6.780和7.321,差异均有统计学意义(P<0.001)(表略)。

表1 CC组与对照组血细胞相关指标的比较

2.3 联合化疗对OC患者CA125和HE4水平的影响

OC患者化疗前血清CA125和HE4水平显著高于对照组(P<0.001);化疗后二者水平显著降低(P<0.001)而接近对照组水平(表2)。

3 讨论

业已证明,恶性肿瘤细胞与血管内皮相互作用引起的凝血系统级联反应,增加血栓形成风险的同时,又促进了肿瘤细胞的增殖和转移[6-7]。内皮细胞组织因子(tissue factor,TF)的表达受VEGF调控,此过程系由VEGF受体样酪氨酸激酶和含激酶插入区的受体所介导[8]。新近研究证实,肿瘤TF的表达可增强VEGF表达和下调血小板敏感素(thrombospondin)以促进血管生成,并通过改变癌细胞的表型而促进肿瘤的发生、增殖和转移[5,9]。癌患者PLT池中VEGF含量占循环总量的80%以上,PLT数量的增加可加剧上述病理过程[10]。PLT通过调节细胞外基质动力学和招募粒细胞,形成致瘤微环境,从而诱导抗失巢凋亡(anoikis)。这是其促进肿瘤恶化的关键所在,也是癌细胞转移的重要标志[4,6,11]。已证实,PLT在内皮细胞与淋巴细胞或单核/巨噬细胞之间具有桥梁作用,PLT一旦被凝血酶活化便可增强肿瘤细胞的血行转移,可能是肿瘤细胞“促凝活性”相关促转移的重要机制[12-13]。本研究发现OC患者PLT计数增加与血清CA125和HE4水平升高平行,提示PLT与OC的发生发展及预后不良相关,与报道一致[12]。与之不同之处在于本研究同步检测了OC组织病理学和VEGF表达的改变。

OC的早期诊断一直是亟待解决的重要课题,而与OC密切相关的分子靶向治疗备受临床关注[14]。临床上,血清CA125是OC重要的单一肿瘤标记物[15];其变化可反映OC患者体内瘤负荷,而VEGF水平则反映肿瘤淋巴播散能力,两者联合检测具有较好的预测OC淋巴结转移价值。目前国际公认的OC化疗一线方案为紫杉类化合物联合铂类抗肿瘤化疗[15-16]。紫杉醇为植物类细胞周期特异性药物,作用于细胞M期,加强微管蛋白聚合,同时抑制微管的解聚,形成非功能性微管束,破坏细胞的有丝分裂而发挥抗癌作用。OC患者PLT计数、VEGF表达与血清CA125、HE4水平升高呈一致性改变,提示其可能存在共同的信号通路。经联合化疗后的OC患者VEGF表达明显下调,可能与化疗直接抑制PLT衍生微粒和下调VEGF蛋白表达有关,其调控机制尚待进一步研究。