特发性震颤患者NOTCH2NLC基因动态突变筛查

张忻怡，赵熙萌，杨英麦，万新华，崔丽英，张 学，柳 青*

1.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 麦库西克-张孝骞协和遗传医学中心 疑难重症及罕见病国家重点实验室，北京 100005；2.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 神经内科，北京 100730

特发性震颤(essential tremor,ET)是常见的神经系统疾病之一,全世界各年龄组的患病率为0.9%,并且患病率随着年龄的增长而增加,在65岁以上的人群中达到4%[1]。超过一半的ET患者有家族病史[2],对双胞胎的研究显示,约60%的同卵双胞胎有家族病史[3-4]。典型的ET以自主运动时触发的动作性震颤为特征,主要影响上肢,病程至少3年[5]。ET还可导致其他运动、精神和感觉障碍,如轻度共济失调、肢体姿势异常和记忆受损,被归类为“特发性震颤附加症”[6-7]。

Notch同源物2N末端样蛋白C(Notch homolog 2 N-terminal-like protein C,NOTCH2NLC)基因5′非翻译区GGC重复扩增突变与一系列神经退行性疾病有关,包括特发性震颤(ET)、帕金森病(Parkinson′s disease,PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral scler-osis,ALS)和其他疾病[8]。在欧洲人群和中国人群中均存在由NOTCH2NLCGGC重复扩增突变导致的ET[9-12]。本研究结合三引物PCR(triplet repeat primed PCR,TP-PCR)、二代测序技术(next generation sequencing, NGS),运用相关基因诊断技术和遗传学分析方法,对110例就诊于北京协和医院神经内科的ET患者队列进行研究,为该病的基因诊断、遗传咨询和治疗补充依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象:收集2016年9月至2018年12月在北京协和医院神经内科就诊的特发性震颤患者110例,所有患者均符合国际帕金森病与运动障碍学会特发性震颤的诊断标准[7],健康对照样本是年龄和性别匹配的无已知神经系统疾病的个体187名。所有参与者均已签署知情同意书,该研究遵循赫尔辛基宣言(Helsinki Declaration),并获得北京协和医院伦理委员会的审查批准(JS-2624)。

1.1.2 试剂:DNA提取试剂盒(Qiagen公司);dsDNA定量试剂盒(Thermo Fisher公司);Ion Xpress 片段文库试剂盒(Life Technologies公司);OneTouch Template 200 试剂盒(Life Technologies公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集与DNA提取:留取患者及对照组的外周静脉血,使用全血细胞DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA。

1.2.2NOTCH2NLC动态突变检测:使用在线工具(http://primer3.ut.ee/)设计引物序列。PCR 反应采用 TP600梯度PCR 热循环仪,成对引物在正向引物的 5′端添加 6-羧基荧光(6-carboxyfluorescein,6-FAM)标签。检测NOTCH2NLC(GGC)n重复扩增的方法按照文献[13]进行。PCR 产物在 ABI 3730 DNA 分析仪上运行,内置 GeneScan 500 ROX 尺寸标准。原始片段分析数据由GeneMapper v4.0软件处理,以获得准确的重复数。以NOTCH2NLC中重复数异常的 DNA 样本作为内对照。

1.2.3 筛查子组(panel)测序:对于自行设计的包含44个神经退行性疾病相关基因的基因组 panel进行 NGS分析。靶区覆盖所有外显子及邻近内含子区域±20 bp。使用在线工具 Ion AmpliseqTMDesigner(http://www.ampliseq.com/)设计引物。DNA定量检测采用Qubit 2.0荧光仪和 Qubit dsDNA定量试剂盒。使用10 ng gDNA构建文库,使用带有Ion Xpress条形码适配器的片段文库试剂盒进行条形码编码,在Ion OneTouch 2上使用 OneTouch Template 200试剂盒进行扩增,在Ion OneTouch ES上进行富集,并在Ion Torrent PGM平台上进行测序。NGS测序引物经退火处理后与Ion PGMTM测序聚合酶结合,加载到Ion 318TMv2芯片上完成测序。

1.3 统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0.1 Windows版本对重复计数进行统计分析。如果重复数符合正态分布,则采用Kolmogorov-Smirnov检验。重复数比较采用Mann-Whitney非参数检验。突变负荷分析采用加或不加Yate校正的卡方检验和Fisher-exact检验。P<0.05为差异有统计学意义。利用SIFT、polyphen2和CADD v1.5等对变异的有害水平进行预测,参考2015年美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG)[14]针对序列变异解读的标准和指南,对所得到变异的有害性进行分类,关注分类为致病、可疑致病和意义不明确的变异。

2 结果

2.1 患者临床信息

本研究纳入了110例ET患者,男性56例,女性54例,发病年龄为(36.30±17.64)岁,有家族史者占74.8%;187名对照组男性107例,女性80例,平均年龄(48.6±7.1)岁。

2.2 NOTCH2NLC (GGC)n的重复扩增分析

在110例ET患者和1例神经元核内包涵体病患者中对NOTCH2NLC(GGC)n动态突变进行分析,1例神经元核内包涵体病患者作为阳性对照携带(GGC)n重复扩增突变。结果显示ET患者NOTCH2NLC的重复数(GGC)n均在10-47(平均18.6±5.4)的正常范围内(图1),在ET患者队列中未发现异常扩增。

Positive control panel revealed a saw-tooth pattern of the repeat expansion;ET patient panel showed no repeat expansion.

2.3 panel测序结果分析及致病性预测

在ET患者和对照组42个基因中分别发现了209个和255个罕见变异。计算突变负担,PLA2G6罕见变异数有统计学意义(校正后P<0.05)。在对照组中未检测到PLA2G6的变异。PLA2G6变异的详细信息见表1。根据ACMG标准,PLA2G6中的变异被定义为意义不明确。所有42个基因的突变负荷实验结果见表2(本研究的panel共包括44个基因,其中FUS和HTRA2中未发现罕见变异)。

表1 特发性震颤患者PLA2G6罕见变异的描述Table 1 Description of PLA2G6 rare variants detected in patients with essential tremor

表2 二代测序筛查子组(panel)中涉及的基因突变负担分析Table 2 Mutation burden analysis of genes involved in the next generation sequencing panel

3 讨论

越来越多的研究证实NOTCH2NLC基因与许多神经系统疾病相关,如神经元核内包涵体病、特发性震颤、多系统萎缩、帕金森病、阿尔茨海默病,甚至眼咽远端肌病[15]。异常重复扩增与一系列神经退行性疾病有关。最近有报道称,在5.58%的中国ET家系中,NOTCH2NLC的(GGC)n重复扩增是导致ET发生的原因[9]。尽管NOTCH2NLC(GGC)n重复扩增被报道是家族性ET的病因,但在本研究队列中没有发现这一突变,再次表明其作为ET遗传机制的罕见性。

最近的研究越来越多地将特发性震颤的位置定位于小脑和小脑系统,并在小脑内发现了许多神经退行性变化,表明这种进行性疾病可能是退行性的[16]。因此,本研究使用针对ALS、AD、PD和额颞叶痴呆(frontotemporal lobar dementia,FTD)设计的panel进行ET的变异分析,筛选与ET发病相关的基因。结果发现PLA2G6的杂合变异负担与ET病因学有关。本研究在ET患者中发现的4个罕见PLA2G6变异均为杂合变异,致病性预测为意义不明确。PLA2G6是一种不依赖钙的磷脂酶A2,它能催化磷脂中sn-2酰基酯键的水解,其编码蛋白的功能障碍与脑铁积累的神经变性、婴儿神经轴突营养不良和常染色体隐性帕金森病有关。需要进一步的遗传或功能研究来验证这些变异在特发性震颤中的致病性。同时,ET与PLA2G6变异负担的关联可能表明ET的遗传异质性。

综上所述,NOTCH2NLC突变在特发性震颤患者中是罕见的。这种阴性结果可能是由于受试者数量有限;同时,这表明NOTCH2NLC在ET发病机制中的罕见性。