艾司氯胺酮减轻大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤

袁培根，陈顺利，单鸳露，薛彬彬，叶玉柱，林丽娜

温州医科大学附属第一医院 麻醉科，浙江 温州 325000

肢体缺血再灌注损伤(limb ischemia-reperfusion injury, LI/R)是指肢体在缺血一段时间后没有明显的组织损伤,反而在恢复血流供应后,重新获得血液灌注的组织出现损伤的病理生理现象。诸如远端血管重建术、断肢再植与止血带的长期应用等皆可引发一定程度的LI/R[1]。LI/R在相关临床科室诊疗过程中时常发生,为此减轻再灌注损伤是迫在眉睫的问题。有研究已经证实氯胺酮对缺血再灌注损有保护作用,并且发现Nrf2信号蛋白参与其中[2-3]。也有研究观察到,艾司氯胺酮可通过抗氧化对创伤性脑损伤有保护作用,可以促使Nrf2核内转移增多,从而上调相关联的抗氧化蛋白生成,起到神经保护作用[4]。因此在本研究中,通过观察艾司氯胺酮与Nrf2通路的关系,探究其减轻肢体缺血再灌注损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:SPF级雄性SD大鼠21只,体质量280～320 g,温州医科大学实验动物中心[SYXK(浙)2021-0017]。

1.1.2 主要试剂:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、肌酸激酶(creatine kinase, CK)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)试剂盒(南京建成公司);胞质胞核蛋白提取试剂盒(普利莱公司);山羊抗兔二抗IgG、小鼠抗大鼠Nrf2单抗、兔抗大鼠HO-1单抗、山羊抗小鼠二抗IgG(Abcam公司);BCA Protein Assay Kit(Thermo公司);免疫组化试剂盒(福州迈新公司);艾司氯胺酮(江苏恒瑞医药股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组:将大鼠分为3组,sham组、I/R组(无创动脉夹夹闭,侧支循环用橡皮筋恒定张力结扎,缺血3 h再灌注2 h)、ESK组(艾司氯胺酮,腹腔注射,5 mg/kg)每组7只。大鼠腹腔注射25%的乌拉坦5 mL/kg麻醉,造模成功后取全血,分离血清,骨骼肌留作检测。

1.2.2 骨骼肌湿/干重比值(W/D)的测定:切取少量骨骼肌,马上对湿重进行称量,接着移至恒温干燥箱(55 ℃)里至恒重,确定出干重,经由W/D可评价腓肠肌的水肿情况。

1.2.3 骨骼肌HE染色观察:用10%多聚甲醛保存骨骼肌,固定6 h,常规脱水、透明、石蜡包埋,最后切片并染色观察。

1.2.4 血清CK、LDH的检测:大鼠血浆37 ℃水浴5 min,再于3 000 r/min、4 ℃行离心处理,取上清,按试剂盒说明书测定。

1.2.5 骨骼肌MDA/SOD的检测:对组织精准称量,加入0.9%氯化钠溶液,制备10%组织匀浆,于2 500 r/min离心10 min,取上清,同时分为2份备检。对用来测定SOD的一份还需加入0.9%氯化钠溶液行20倍稀释,取样50 μL检测。

1.2.6 Western blot测定腓肠肌Nrf2与HO-1蛋白表达:提取胞质、胞核蛋白,BCA法测蛋白浓度。蛋白在10% SDS-PAGE中室温电泳分离,Nrf2(300 mA、70 min)、HO-1(300 mA、50 min)湿转至PVDF膜上,经由脱脂奶粉(5%)封闭2 h,分别加β-action、HO-1、Nrf2、TBP一抗(稀释度依次为1∶5 000、1∶500、1∶2 000、1∶500),4 ℃孵育过夜,TBST洗涤3次,10 min/次,二抗室温孵育60 min,用TBST洗膜3次,10 min/次,ECL覆盖条带,于暗室内完成显影、定影处理,再冲洗胶片,晾干。先扫描胶片,再通过Image J对各目标条带吸光度(OD)值分析,同时通过目标蛋白OD值与相应内参OD值之比反映目标条带相对强度。

1.2.7 免疫组化检测腓肠肌Nrf2和HO-1蛋白表达:对石蜡切片采取常规脱蜡水化,灭活内源过氧化物酶活性,抗原修复,血清封闭,再滴加Nrf2与HO-1一抗,酶标记二抗,DAB显色,苏木精轻微复染,脱水透明封片。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组骨骼肌湿/干重的比值

与sham组比较,I/R组W/D值显著上调(P<0.05);与 I/R组比较,ESK组W/D值显著下调(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with sham; △P<0.05 compared with I/R.

2.2 各组HE染色腓肠肌形态变化

在sham组,肌纤维以多边形态规则分布,无细胞肿胀,无间质结构异常,血管附近无明显炎性细胞存在;相比sham组,I/R组细胞分布缺乏规则性,染色变淡、无明确界限,细胞大幅肿胀,间质有弥散红细胞分布,血管附近存在众多炎性细胞;在ESK组,细胞分布缺乏规则性,细胞染色变淡、界限较为模糊,间质偶有红细胞,血管附近存在少量炎性细胞,但相较I/R组大幅改善(图2)。

A.sham group; B.I/R group;C.ESK group

2.3 各组血清CK、LDH变化

就CK水平与LDH活性而言,相比于sham组,I/R组均显著上调(P<0.05);相比于I/R组,ESK组均显著下调(P<0.05)(表1)。

表1 各组血清CK、LDH的结果Table 1 The serum CK and LDH in each

2.4 各组大鼠骨骼肌MDA、SOD结果

相比于sham组,I/R组MDA水平显著上调(P<0.01),SOD活力显著下调(P<0.01);相比于I/R组,ESK组MDA水平显著下调(P<0.01), SOD活力显著上调(P<0.01)(表2)。

表2 各组骨骼肌MDA、SOD结果

2.5 Western blot检测骨骼肌Nrf2和HO-1蛋白的表达

相比于sham组,I/R组胞质HO-1、胞核Nrf2相对表达量上调(P<0.05);相比于I/R组,ESK组胞质HO-1、胞核Nrf2的相对表达量显著上调(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with sham; △P<0.05 compared with I/R.

2.6 免疫组化检测骨骼肌Nrf2和HO-1蛋白的表达

Nrf2 及HO-1蛋白大量存在于腓肠肌细胞胞质中,也可见于胞核中。Sham组Nrf2及HO-1蛋白呈低表达;I/R组Nrf2和 HO-1表达增多;ESK组,艾司氯胺酮处理大鼠腓肠肌组织中Nrf2和 HO-1表达进一步增加(图4)。

图4 免疫组化检测各组骨骼肌Nrf2和HO-1蛋白的表达情况Fig 4 The protein expression of Nrf2 and HO-1 in each group detected by IHC

3 讨论

本实验结果表明艾司氯胺酮(ESK)可有效保护LI/R。同时也发现,艾司氯胺酮可以上调LI/R后的Nrf2核蛋白表达,使相关抗氧化蛋白生成增多,减轻肢体缺血再灌注所造成的损伤。

LI/R是临床诊疗中不可小觑的问题,在它的众多致伤因素中,有研究提出活性氧学说、炎性介质学说[5-6]。氧化应激发生时,氧及其衍生的自由基具有极强的化学活性,会攻击细胞膜,并与其不饱和脂肪酸发生氧化反应,破坏细胞的离子通透性及完整性,同时也会影响膜的结合酶、受体与离子的脂质微环境,引起细胞内钙负荷过重,产生损伤[7]。氧化应激引起骨骼肌湿干重比值增高,光镜观察到肌纤维排列紊乱、间质中出现炎性细胞,骨骼肌细胞释放出大量CK、LDH,代谢产物MDA蓄积,内源性自由基清除剂SOD水平降低。

相关研究证实,Nrf2/HO-1抗氧化防御途径的作用显著,在细胞对抗氧化应激反应调控方面,转录因子Nrf2起着核心作用[8]。上调此信号途径能够提高诸多抗氧化酶的反应速度,上调谷胱甘肽(GSH)与超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化物质的表达量,使细胞中氧化还原得以保持平衡,从而有效保护细胞[9]。静息时Nrf2在胞质内分布,结合Keapl蛋白,若活性氧等来源的信号对其施以刺激,Nrf2会自复合物解离,同时向胞核内转移,调节抗氧化酶如血红素加氧酶(HO-1)、过氧化氢酶(CAT)等的表达,如此能够发挥抗氧化活性[10]。有文献证实,艾司氯胺酮经腹腔给药后,有效的降低了脓毒症大鼠心肌氧化应激水平,同时心肌组织HO-1与Nrf2表达提升,Bach1表达降低,证明艾司氯胺酮通过活化 Nrf2/HO-1信号通路,改善机体氧化应激状态,从而减轻脓毒症心肌损伤达到心肌保护的作用[11]。本研究也发现艾司氯胺酮在肢体缺血再灌注中可以上调Nrf2 和HO-1表达,减轻大鼠骨骼肌的损伤,起到抗氧化的作用。本文存在一定的局限性,艾司氯胺酮作用于Nrf2通路的具体机制尚未证实,也未设置Nrf2拮抗剂组,有待以后进一步发现与研究。

综上,本研究表明艾司氯胺酮对缺血再灌注损伤有保护作用,可能是通过Nrf2通路实现的。