miR-155 对支气管哮喘患儿Th1/Th2细胞失衡的影响及机制研究

陈智 魏静丽 田芸

支气管哮喘是多发于小儿时期的慢性呼吸系统疾病[1]。该病是由多类细胞及促炎因子共同参与形成的气道炎症性疾病[2]。据流行病学调查显示，中国儿童支气管哮喘患病率正以每10 年增加50%以上的幅度上升，且该病的控制情况十分不理想[3]。目前，支气管哮喘的发病机制仍未完全清晰。研究表明，T 淋巴细胞在支气管哮喘进展中起着重要作用，其中Th1 与Th2 比例失衡是支气管哮喘发生的重要因素[4]。研究证实，miR-155 参与咳嗽变异性支气管哮喘、急性胰腺炎和肺炎等慢性炎症性疾病的发生、发展[5]，但关于其在儿童支气管哮喘中的作用尚不明确。基于此，本研究就miR-155 对支气管哮喘患儿Th1/Th2 细胞失衡的影响及致病机制作一探讨，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018 年7 月至2022 年6 月在深圳市前海蛇口自贸区医院就诊的40 例支气管哮喘发作期患儿为哮喘组，其中男19 例，女21 例；年龄7～12（9.18±1.97）岁；BMI 为（19.24±1.41）kg/m2。纳入标准：（1）支气管哮喘的诊断符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016 年版）》[6]相关诊标准；（2）年龄6～14岁。排除标准：（1）合并先天性气道畸形；（2）伴有精神障碍；（3）合并严重躯体疾病；（4）病例资料完整；（5）支气管异物、致敏物等外物诱发的反复喘息。另选同期本院健康体检的30 名儿童为对照组，其中男15人，女15 人；年龄7～12（9.13±1.80）岁；BMI 为（19.25±1.22）kg/m2。两组对象在性别、年龄和BMI 等方面比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会审查通过，所有患儿家长知情同意。

1.2 体内试验

1.2.1 两组对象外周血Th1 和Th2 细胞亚群水平检测采用流式细胞术。取支气管哮喘发作期患儿入院第2 天清晨及体检儿童健康体检时的空腹肘静脉血5 mL，使用FACSCanto Ⅱ流式细胞检测仪测定外周血Th1 比例和Th2 比例，计算Th1/Th2。

1.2.2 两组对象外周血细胞因子水平检测 采用ELISA 法。 取支气管哮喘发作期患儿入院第2 天清晨及体检儿童健康体检时的空腹肘静脉血5 mL，采用ELISA 法检测外周血IL-4、IL-5、IL-1、IL-17、IFN-γ水平，试剂盒均购自北京市索莱宝科技有限公司。

1.3 体外试验

1.3.1 外周血CD4+T 细胞分离 参考文献[7]分离步骤，使用α-CD3 磁珠（批号：130-050-101，德国美天旎生物技术有限公司）、α-CD28 磁珠（批号：130-093-247，德国美天旎生物技术有限公司）分别分离哮喘组、对照组外周血CD4+T 细胞，设为哮喘（细胞）组、对照（细胞）组；另用miR-155 模拟物处理对照组分离获得的CD4+T 细胞，设为miR-155 高表达组。3 组CD4+T 细胞均体外培养24 h 后取上清液进行RT-qPCR 和ELISA 检测。

1.3.2 3 组CD4+T 细胞miR-155、GATA结合蛋白3（GATA binding protein-3，GATA-3）表达水平检测采用RT-qPCR 法。使用Trizol 提取各组细胞总RNA，反转录成cDNA。使用RT-qPCR 仪检测miR-155、GATA-3 表达水平，采用2-ΔΔCt法计算miR-155、GATA-3 相对表达量。引物序列由深圳市牛启生物技术有限公司合成，GATA-3 上游引物序列为5'-GAGGTGGACGTACTTTTTAACATCG-3'，下游引物序列为5'-GGCATACCTGGCTCCCGT-3'；β-肌动蛋白上游引物序列为5'-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3'，下游引物序列为5'-TAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3'；miR-155 上游引物序列为5'- GCGCGTTAATGCTAATT GTGAT-3'，下游引物序列为5'- GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 上游引物序列为5'-CGGGTTTGTTTTGCATTTGT-3'，下游引物序列为5'-AGTCCCAGCAT GAACAGCTT-3'。

1.3.3 3 组CD4+T 细胞IL-4、IL-5 表达水平检测 采用ELISA 法。使用IL-4 试剂盒（批号：SEKH-0011-96T，北京市索莱宝科技有限公司）、IL-5（批号：SEKH-0012-96T，北京市索莱宝科技有限公司）测定CD4+T 细胞上清液IL-4、IL-5 表达水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 23.0 统计软件。计量资料以表示，若满足方差齐性，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；若方差不齐，两组间比较采用t'检验。计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组对象外周血Th1 和Th2 细胞亚群水平比较哮喘组外周血Th1 比例、Th1/Th2 均明显低于对照组，Th2 比例明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 两组对象外周血Th1和Th2细胞亚群水平比较

2.2 两组对象外周血细胞因子水平比较 哮喘组外周血IFN-γ 水平明显低于对照组，IL-4、IL-5、IL-1、IL-17 水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 两组对象外周血细胞因子水平比较（ng/L）

2.3 3 组CD4+T 细胞miR-155、GATA-3、IL-4、IL-5 表达水平比较 3 组CD4+T 细胞miR-155、GATA-3、IL-4、IL-5 表达水平比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；哮喘（细胞）组、miR-155 高表达组CD4+T 细胞miR-155、GATA-3、IL-4、IL-5 表达水平均明显高于对照（细胞）组（均P＜0.05），见表3。

表3 3 组CD4+T 细胞miR-155、GATA-3、IL-4、IL-5 表达水平比较

3 讨论

支气管哮喘是一种由多类炎症细胞、细胞分子介入的慢性炎症疾病，多发于童年期和青春期[8]，其患病率呈逐年上升趋势[9]。若严重的支气管哮喘急性发作时得不到及时治疗，可能导致患儿死亡，对家庭和社会增加沉重的负担[10]。因此，积极探索支气管哮喘的发病机制对该病的防治具有重要意义。

既往研究显示，Th1/Th2 细胞失衡是支气管哮喘发病的主要机制[11]。在支气管哮喘致病进程中，Th1/Th2处于持续变化状态，表现为Th1 比例及相关细胞因子水平降低和Th2 比例及相关细胞因子水平升高的过程，其中抑制促炎因子水平降低在气道炎症持续存在过程中起着重要作用[12]。本研究也得到类似结论，哮喘组外周血Th2 比例、IL-4、IL-5、IL-1 和IL-17 水平均明显高于对照组，Th1 比例、Th1/Th2 和IFN-γ 水平均明显低于对照组，表明支气管哮喘患儿存在Th1/Th2细胞失衡的状况。Th1 释放的主要抑炎因子有IL-2、IFN-γ 等，它们参与细胞免疫调控；Th2 释放的主要促炎因子有IL-4、IL-5 等，它们参与体液免疫调控。当Th1/Th2 动态平衡被破坏时，释放的细胞因子种类占比会发生较大的改变，进而诱发支气管哮喘的发病[13]。据文献报道，恢复Th1/Th2 细胞失衡，同时降低Th17 水平、提高Treg 的免疫抑制功能等，均有助于缓解儿童支气管哮喘[14]。Th17 能特征性地分泌IL-17，而IL-17 具有很强的促炎作用，与气道高反应性有关。哮喘小鼠模型的实验研究发现，减少Th1 分化和增强Th2 细胞分化后，会显著提高组织中胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶3 水平，进一步证实Th1/Th2 细胞失衡诱发哮喘的发病[15]。因此，活化Th1 并抑制Th2 免疫应答，恢复Th1/Th2 细胞平衡是治疗支气管哮喘的有效方法之一。

miRNA 是一类长约22 个核苷酸序列的非编码单链RNA，其表达失调与人类疾病密切相关。研究表明，支气管哮喘的发生、发展与miR-155 的高表达密切相关[16]，但确切机制尚未清楚。本研究结果显示，哮喘（细胞）组、miR-155 高表达组CD4+T 细胞miR-155、GATA-3、IL-4 和IL-5 水平均明显高于对照（细胞）组，提示miR-155 可能通过上调GATA-3 表达来促进CD4+T 细胞向Th2 分化，进而造成支气管哮喘患儿Th1/Th2 细胞失衡的生物学机制。转录因子GATA-3是一类具有高度选择性促进Th2 分化功能的因子，可高度选择性地促进Th2 发育、诱导产生Th2 型细胞分子和阻遏Th1 型细胞特异分子。近年来研究表明，miR-155 在异氰酸盐诱导的哮喘小鼠模型中发挥重要作用，其高表达可促进炎症反应和气道高反应性[16]。2型固有淋巴细胞（type 2 innate lymphoid cells，ILC2）也属于淋巴细胞中的一员，能被细胞因子IL-33、胸腺基质淋巴细胞生成素和IL-25 所激活，进而增强Th2 型细胞特异性转录分子GATA-3、视黄酸受体相关孤儿受体α 水平，促进IL-4、IL-5 等细胞因子释放。在过敏性气道炎症小鼠实验中发现，miR-155 缺陷小鼠肺器官中没有炎症细胞富集，IL-33 含量明显减少，ILC2数量明显减少；IL-33 能通过促进野生型小鼠ILC2 的相关受体以及miR-155 表达，使小鼠肺组织GATA-3含量增加并释放更多的IL-13，这说明miR-155 在IL-33 刺激ILC2 增加以及嗜酸性粒细胞气道炎症过程中是必不可少的[17]。近期研究显示，血清miR-155 异常高表达与支气管哮喘的发生存在必要关联[18]。上述研究结论与本研究基本一致。

综上所述，miR-155 异常高表达在儿童支气管哮喘发病中发挥重要作用，其机制可能与上调GATA-3表达进而造成Th1/Th2 细胞失衡有关。