基于生物信息学分析LAD1 对乳腺癌的预后预测及募集肿瘤相关巨噬细胞作用的研究

周少丞 毛琦淇 季晓春 滕伟峰 张佳男

根据WTO 国际癌症研究机构发布的2020 年全球癌症数据报告，乳腺癌的新发病例数正迅速增加，已超越肺癌，成为全球首位。此外，乳腺癌的死亡病例数也位居世界之首，突显了其对全球公共卫生的重大挑战[1]。近年来，在全球范围内已开展了大量关于乳腺癌发病潜在机制的研究。针对乳腺癌包括手术、化疗、内分泌治疗、靶向治疗等在内的综合诊疗水平不断提高。但是，仍有部分患者出现耐药、复发及转移，患者的生存率显著降低、预后不良。因此，需要寻找一种新的抗乳腺癌治疗策略。肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移本质上依赖于细胞骨架蛋白的机械运动。通过前期研究发现，LAD1 作为一个细胞骨架相关蛋白，在肿瘤的发生及发展中起到重要作用。有基因组学研究发现，LAD1 蛋白在基底细胞样和三阴性乳腺癌中表达，提示LAD1 与乳腺癌的恶性程度相关，其高表达可提示患者预后不良[2-3]。且有研究报道提示，LAD1 在喉癌、口腔鳞癌中表达，并在肿瘤的进展中发挥重要作用[4]。因此，本文将探究LAD1 作为一个骨架相关蛋白，在乳腺癌的发生、发展过程中是否起重要作用。

1 材料和方法

1.1 LAD1在不同肿瘤中的表达差异分析 通过TIMER 2.0数据库（http://timer.cistrome.org/）[5]，类型选择“LAD1”，分析LAD1 在不同癌症组织中的差异表达。

1.2 乳腺组织样本收集 登陆癌症基因组图谱（The Cancer Genome Altas，TCGA）在线数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/），筛选条件：（1）Primary Site: Breast；（2）Program: 人类肿瘤基因组（the cancer genome altas，TCGA）数据库下载；（3）Project: TCGA-BRCA；（4）Disease Type: ductal and lobular neoplasms；（5）Data Category:transcriptome profiling；（6）Data Type: Gene Expression Quantification。

1.3 LAD1 mRNA 表达水平差异分析 利用TCGA 数据库分析LAD1 mRNA 在乳腺癌肿瘤组织样本和正常乳腺组织样本中的表达差异。

1.4 LAD1 蛋白表达水平验证 利用人类蛋白质质谱查询网站（www.proteinatlas.org）检索LAD1 蛋白在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达差异。

1.5 样本组织中浸润免疫细胞比例分析 采用CIBERSORT 算法推断每个样本组织的22 种免疫细胞的相对比例[6-7]。

1.6 京都基因和基因数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 利用“clusterProfiler”和“ggplot2”软件包对样本进行KEGG 富集分析。

2 结果

2.1 LAD1 蛋白在乳腺癌组织中高表达 通过TIMER 2.0 数据库分析，LAD1 蛋白在乳腺癌组织中表达明显高于乳腺正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 LAD1 蛋白在泛癌中的表达水平

2.2 LAD1 mRNA 在乳腺癌组织与正常乳腺组织中表达的比较 通过对TCGA 数据库的数据挖掘，收集得到转录组数据样本共1 182 例，其中乳腺癌样本1 070例，正常乳腺组织样本112 例。统计数据提示，与正常乳腺组织比较，LAD1 mRNA 在乳腺癌组织中高表达，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 LAD1 mRNA 在乳腺癌组织及正常乳腺组织中的表达水平（A：乳腺癌组织及正常乳腺组织中LAD1 mRNA 表达水平比较，与正常乳腺组织比较，aP＜0.01；B：乳腺癌组织及正常乳腺组织中LAD1 mRNA 表达水平比较，与正常乳腺组织比较，aP＜0.05）

2.3 LAD1 mRNA 在不同年龄、性别患者中的比较通过TCGA 数据库分析介于65 岁上下患者及女性和男性乳腺癌中LAD1 mRNA 的表达水平差异。统计数据发现，相对于年龄＞65 岁患者，LAD1 mRNA 在≤65岁患者中表达更高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3A。而在女性和男性乳腺癌患者中，LAD1 mRNA的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见图3B。

图3 LAD1 mRNA 在乳腺癌中的表达水平（A：不同年龄患者LAD1 mRNA 表达水平比较，aP＜0.05；B：不同性别患者LAD1 mRNA表达水平比较）

2.4 免疫组化染色结果 通过人类蛋白质谱查询网站（www.proteinatlas.org），检索乳腺癌组织和正常乳腺组织LAD1 蛋白的免疫组化染色结果，可见乳腺癌病理组织中LAD1 蛋白的表达高于正常乳腺组织，见图4。

图4 LAD1 蛋白在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达（A：乳腺癌组织中LAD1 蛋白的表达情况；B：正常乳腺组织中LAD1 蛋白的表达情况）

2.5 LAD1 的表达与乳腺癌中浸润的免疫细胞之间的相关性 本研究使用CIBERSORT 算法计算低风险和高风险队列之间免疫细胞分数的比较。结果显示，高表达LAD1 基因在乳腺癌免疫微环境中与M2 型巨噬细胞、树突细胞细胞静息、嗜酸性粒细胞的表达呈正相关，且差异均有统计学意义（均P＜0.05）。高表达LAD1 基因与记忆性B 细胞、初始B 细胞和浆细胞的表达呈负相关，且差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5（封三）。

图5 肿瘤微环境中免疫细胞的变化（A：使用CIBERSORT 算法计算低风险和高风险组之间免疫细胞分数；B：京都基因和基因组数据库富集分析低风险和高风险组之间免疫细胞分数）

3 讨论

恶性肿瘤容易出现细胞增殖、侵袭和转移，这是导致其难治性的最主要原因[8]。细胞的增殖、侵袭和转移本质上依赖于细胞骨架蛋白的机械运动。LAD1作为一个细胞骨架相关蛋白，其蛋白分子量约59 kD，在脊椎动物物种中不保守，而且在无脊椎动物中不存在，这表明它的起源较晚[9]。LAD1 蛋白首先是从小鼠皮肤cDNA 文库中克隆得到，编码的蛋白除了包含一个精氨酸和6 个丝氨酸-谷氨酸（SEK）三肽结构域外，没有其他结构域可以识别。

本研究通过TIME 2.0 数据库分析得到LAD1 蛋白在乳腺癌组织中高表达。已有相关文献报道，在对EGF 刺激的乳腺细胞系进行研究分析后，发现LAD1蛋白在EGF 激活的ERK 信号通路中起到了关键的作用。不仅其蛋白表达量有所增加，LAD1 蛋白还经历了结构性修饰。此外，LAD1 蛋白与其他关键的细胞骨架蛋白，如肌动蛋白actin，协同工作，共同调控乳腺癌细胞的增殖和转移。这一发现揭示了LAD1 在乳腺癌进展中扮演了至关重要的角色[10]。相关研究指出，在某些肿瘤中，Akt 和ERK 存在异常的磷酸化现象[11-12]。LAD1 不仅能与F-actin 形成复合体，还可以调节下游的Akt 和ERK 的磷酸化状态。这种调节作用进一步影响癌细胞的增殖和转移能力[10]。根据以上已有的研究，LAD1 蛋白可通过影响重要信号通路等方式影响乳腺癌的增殖、侵袭及转移。

肿瘤微环境作为肿瘤免疫研究当中最为重要环节，肿瘤微环境中的肿瘤细胞与免疫细胞相互通，影响肿瘤的发生、发展和转移。趋化因子是一组可溶性，大小约为8～14 kDa 的小分子蛋白，是天然免疫系统的重要组成部分[13]。它可以通过与细胞表面G 蛋白偶联受体结合，发挥生物学相关作用，如刺激各类白细胞的定向和（或）非定向迁移。在肿瘤微环境中，趋化因子可以由肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞分泌，分泌的趋化因子和细胞表面受体结合可激活多种信号途径，并募集免疫细胞亚群进入肿瘤微环境中[14]。有研究提示，乳腺癌细胞株MCF-7 和T47D 产生的CCL5 可以自分泌方式直接或间接通过刺激基质金属蛋白酶9 的表达等途径促进肿瘤的发展[15]。本团队对乳腺癌TCGA 数据数据库的分析发现，LAD1 与肿瘤微环境中的M2 型巨噬细胞的表达呈正相关。M2 型巨噬细胞在诱导血管生成、限制免疫反应和组织修复方面起着关键作用。一旦外周血中的单核细胞被招募到肿瘤部位，肿瘤微环境下可以迅速将单核细胞分化成TAMs。因此推测，LAD1 是否可以通过调节乳腺癌某种趋化因子，募集得到M2 型巨噬细胞，间接影响乳腺癌的增殖、侵袭及转移。

LAD1 蛋白在乳腺癌的发展中起到了重要的角色。它不仅参与了EGF 激活的ERK 信号通路，还影响了细胞骨架蛋白的动态调控和与Akt 和ERK 的磷酸化状态，从而调节乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。此外，肿瘤微环境中的交互作用对于肿瘤的发展和转移也具有关键意义。趋化因子在肿瘤微环境中扮演了重要的角色，能够影响免疫细胞的活性和迁移。特别地，LAD1 与肿瘤微环境中的M2 型巨噬细胞呈正相关，这些细胞在肿瘤的生长、转移和免疫逃逸中起到了关键作用。总之，LAD1 蛋白和肿瘤微环境的相互作用为乳腺癌的治疗提供了新的机制和潜在的治疗靶点。