精子线粒体DNA ATP6、ATP8 和COX3突变与弱精症的关系

陈孟权 单婷婷 林春春 孔万仲

男性不育症是指夫妇双方未采取避孕措施同居生活1 年以上，男方因素导致女方不孕的疾病。据报道，约50%的不育夫妇是由男性因素导致的，约一半的男性不育患者表现为少精症和弱精症[1]，其中弱精症是指精子前向运动百分率＜32%或精子总活力＜40%。30%～40%的男性均存在一定程度的精子数量或质量异常[1]，约40%的特发性男性不育症表现出遗传易感性[2]，精子线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）作为细胞核外的独立遗传物质，在男性不育中可能发挥重要作用[3]。线粒体主要在氧化磷酸化等过程中发挥作用，是精子结构、运动能力、鞭毛功能和正常受精等环节的能量保障[4-7]。mtDNA 含有呼吸链复合体部分亚基的多肽基因[8]，但由于缺乏组蛋白保护，易受到活性氧（reactive oxygen species，ROS）的损伤，同时其DNA 修复系统作用有限，导致其突变率较核基因高出10～100 倍[9]。目前已有研究发现mtDNA 的高频突变与弱精症相关[10-11]。据报道，在弱精症患者中存在多种类型的mtDNA 大片段缺失，如4977bp、7345bp、7599bp、8476bp、9328bp 等[12-13]，这些缺失区域均包含ATP6、ATP8、COX3、ND3、ND4L、ND4 等片段，其中ATP6 和ATP6/8 重叠区域的T8993G、T9185C 及C8561G突变可能导致复合体Ⅴ的组装不良和稳定性受损[14-15]，COX3 对复合体Ⅳ活性具有调节作用，G9396A突变引起的氨基酸改变可能导致线粒体脑病或肌病[16]。本研究对精子mtDNA ATP6、ATP8、COX3 基因进行测序，分析并探讨这些区域的基因突变与弱精症之间的关系，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2019 年7 月至2021 年3 月在温州市中医院就诊且行精液检查的134 例弱精症患者为弱精症组，均符合第5 版《WHO 人类精液检验与处理实验室手册》中弱精症的相关诊断标准（精液常规检查显示精子前向运动率＜32%或精子总活力＜40%），且有1 年以上不育史，其配偶的妇产科相关检查均正常。选取同期至本院其他原因就诊的129 例精液常规检查结果正常的患者为对照组。弱精症组年龄32（29，35）岁，对照组年龄32（29，36）岁，两组患者年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。纳入标准：（1）留样时禁欲2～7 d；（2）既往体健；（3）无重要脏器损伤及自身免疫性疾病；（4）无睾丸损伤、附睾炎、泌尿系统感染等病史；（5）无相关性腺器官发育异常史；（6）常规精液检查和精子动力形态分析等结果齐全。本研究经本院医学伦理委员会审查通过（批准文号：WZY2021-KT-045），所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 精液常规检查 所有患者按要求留取精液，使用专用容器收集单次射精的全部精液，0.5 h 内保温送检。全部精液样本均置于37 ℃恒温孵箱，待液化后使用精子质量检测分析系统（型号：CFT-9201，江苏瑞祺生命科学仪器有限公司）进行精液常规检查，分析精子总活力、精子浓度等指标。

1.2.2 精子基因组测序分析 采用PCR 法。使用基因组DNA 提取试剂盒（批号：03427，北京天根生化科技有限公司）提取精子基因组DNA，经质量检测合格后存于-20 ℃冰箱内备用。委托上海捷瑞生物工程有限公司合成COX3、ATP6、ATP8 基因引物[17]，引物信息见表1。配置20 μL 反应体系：DNA 模板2 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.6 μL，Primer F/R（10 μmol/L）0.4 μL，Taq酶0.1 μL，ddH2O 11.9 μL。PCR程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃再延伸5 min；4 ℃保存。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外凝胶成像系统（Tanon）确认PCR 产物后送尚亚生物技术有限公司进行测序，为保证测序结果的准确性，全部样本均采用双向重复测序。将测序结果与剑桥标准序列进行比对，查找和分析突变位点。

表1 基因引物序列

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者精液常规检查结果比较 弱精症组精子总活力和精子浓度均明显低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 两组患者精液常规检查结果比较

2.2 两组患者精子基因组测序结果比较 两组患者精子mtDNA ATP6、ATP8、COX3 基因测序结果显示，弱精症组、对照组精子中分别发现86、87 个突变位点，突变类型均以同义突变、错义突变为主；两组患者突变类型、突变区域比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表3。

2.3 两组患者精子mtDNA 基因突变分析 突变发生率＞5%的突变位点共有15 个，其中ATP6、ATP8、COX3 区域分别有8、1、6 个，错义突变、同义突变、移码突变分别有8、6、1 个。本次分析发现3 个未被报道过的突变类型：A8962C、AT9934A、A8812T；其中A8962C、AT9934A 在弱精症组中的发生率均明显高于对照组（均P＜0.05），而A8812T 在对照组中的发生率明显高于弱精症组（P＜0.05），见表4。

表4 两组患者精子mtDNA 基因突变分析

3 讨论

弱精症是多数男性不育症的主要表现，即精子运动能力减弱，进而影响精子细胞功能，最终导致受精失败。作为细胞能量来源的线粒体，主要通过氧化磷酸化产生ATP[18]，是细胞生命活动的保障，与精子活力息息相关。线粒体功能出现任何异常，都可能导致细胞呼吸障碍，ATP 生成不足，对精子的产生和发育造成影响。研究表明，睾丸组织中mtDNA 突变并大量累积可能导致生精细胞呼吸受损、减数分裂停滞以及精子细胞缺氧而发生凋亡等[19]，同时高水平ROS 和自由基对线粒体和mtDNA 均可造成严重损伤，进一步影响精子活力，最终导致男性不育[20]。

据目前已有文献报道，与弱精症相关的mtDNA 大片段缺失有4977bp、7345bp、7599bp、8476bp、9328bp等[12-13]，缺失涉及的区域涵盖ATP6、ATP8、COX3、ND3、ND4L、ND4 等，甚至累及ND5、ND6、CYTB 以及多个tRNA 基因。这些编码基因作为线粒体呼吸链的重要组成部分，其缺失或突变都会影响精子细胞的正常功能。有学者发现COX3 基因的G9267A 突变可损伤氧化磷酸化并促进ROS 产生[21]，ATP6 基因的A8701G 和G9053A 突变会增加受精失败风险[22-23]；此外，在不同肿瘤细胞中能检测到复合体Ⅴ亚基表达下调[24]，多数神经退行性疾病和低生育力与ATP6 基因的A8860G突变有关[17，25-26]。本研究对精子mtDNA ATP6、ATP8、COX3 突变与弱精症的关系作进一步探讨，通过对这些区域进行测序发现，弱精症组与对照组在突变类型、突变区域等方面比较差异均无统计学意义，且突变类型均以同义突变、错义突变为主。本研究进一步作序列比对发现，突变发生率＞5%的突变位点有15个，其中3 个是未被报道过的突变类型（A8962C、AT9934A、A8812T），位于ATP6、COX3 的A8962C 和AT9934A 在弱精症组中的发生率均明显高于对照组，而A8812T 在对照组中的发生率明显高于弱精症组。A8962C 是将该位点编码的苏氨酸变成脯氨酸的错义突变，该突变可能导致呼吸链复合体Ⅴ合成的数量或空间结构发生异常，造成能量供应不足和ROS 失调[27]。COX3 作为人类高保守基因，在复合体Ⅳ活性调节中发挥作用，同时复合体Ⅳ参与形成的超复合物结构又可以减少ROS 的产生[28-29]，而AT9934A 是该位点缺失一个核苷酸导致的移码突变，由此引起的氨基酸顺序错乱，可能造成复合体Ⅳ的活性或稳定性受损。值得关注的是，ATP6 的A8812T 突变使得该位点编码的苏氨酸变为丝氨酸，其在对照组中的发生率为44.19%，但在弱精症组中却未检测到，因此我们推测该突变可能对精子活力起保护作用。

综上所述，精子mtDNA ATP6、ATP8 和COX3 突变与弱精症存在一定的关系，其中A8962C、AT9934A 突变与弱精症的发生有关，而A8812T 突变可能对精子活力起保护作用。