DNA甲基化相关尿液生物标志物在膀胱癌中的研究与应用进展

刘犇 施雨晨

据报道，在全球范围内，膀胱癌发病率位居所有恶性肿瘤的第10 位，死亡率位居第12 位，年龄标准化死亡率男、女性分别为3.30/10 万人年和0.86/10 万人年[1]。在国内，膀胱癌发病率约为5.80/10 万，位居所有恶性肿瘤的第13 位；死亡率约为2.37/10 万[2]。近年来虽然膀胱癌治疗方法在不断进步，但中美两国膀胱癌发病率和死亡率并无明显下降趋势[3]。目前，膀胱镜检查是诊断膀胱癌的金标准，也是其疗效评估与复发监测的主要检查手段[3-4]。这意味着患者需要在初诊或随访过程中接受多次膀胱镜检查。然而，此类有创的侵入性操作具有时间和操作成本高、过程痛苦等缺点，患者依从性往往欠佳。而其他一些非侵入性检查，如尿液脱落细胞学，CxBladder、BTA、Immnocyt/uCyt+、NMP22 等尿液生物标志物或荧光原位杂交检测等，也存在着灵敏度或特异度低、影响因素多、检测成本高等缺点，无法得到大范围的推广应用[5-9]。DNA 甲基化相关尿液生物标志物检测作为一种新兴的非侵入性检测膀胱癌的方法，其临床应用具有较高的实践意义，故本文就这类标志物在膀胱癌中的研究与应用进展作一述评。

1 DNA 甲基化与肿瘤发生

表观遗传学修饰是在不涉及DNA 序列改变的情况下，基因功能所发生的变化；它可以调控包括细胞分化、胚胎发生与转录组异质性在内的诸多生理及病理过程。目前人类研究最广泛的表观遗传学修饰是DNA 甲基化，它会影响DNA 稳定性，引起染色体结构改变，进而导致肿瘤的进展和转移[10-11]。

DNA 甲基化是发生在5'-胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤-3'（CpG）二核苷酸位点的胞嘧啶5'碳原子上的共价修饰，由DNA 甲基化转移酶（DNA methylation transferase，DNMT）等一系列酶活动进行调控，最终得到5-甲基胞嘧啶。其中DNMT3A 与DNMT3B 催化DNA 的从头甲基化，TET1、TET2、TET3 催化去甲基化；连续的细胞分裂也可导致去甲基化，DNMT1 可使DNA 在此过程中保存甲基化状态[12]。CpG 二核苷酸位点在基因组中并非随机平均分布，而是倾向于在编码基因的调控区域（如启动子区）富集成CpG 岛；正常组织中的CpG 岛通常是去甲基化状态，其甲基化一般会导致下游基因的转录抑制。肿瘤发生过程的一个共同特征是甲基化相关酶表达及调节失控导致的全基因组低甲基化、CpG 岛高甲基化异常状态。这可能导致抑癌基因的失活或致癌基因的激活，进而导致细胞增殖与凋亡失常、侵袭和转移激活、代谢重编程、血管生成、免疫逃避等，最终促进肿瘤发生和发展[13-14]。

各项研究表明，DNA 甲基化状态的总体性改变在膀胱癌的转化过程中十分常见且其发生先于肿瘤形成，非肌层浸润性膀胱癌（non-muscular invasive bladder cancer，NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscular invasive bladder cancer，MIBC）具有不同的DNA 甲基化模式。Wolff 等[14]研究发现DNA 低甲基化在低级别、非侵袭性的尿路上皮肿瘤中更为普遍，IPF1、GALR1、TAL1、PENK 和TJP2 的甲基化水平在MIBC 样本中明显高于NMIBC。Robertson 等[15]对MIBC 的综合分子特征进行分析，发现DNA 低甲基化亚群的患者具有较高的生存率，SOX15、CYP2J2、EPHA1 等12 个基因的低甲基化与表达增加显著相关，包括LXN、PARP6、NAPRT和SPATC1L 在内的158 个基因发生了表观遗传沉默。Beukers 等[16]发现PcG 复合物靶基因中的ONECUT2、SOX21 和OTX1 在老年膀胱癌患者中具有更高的DNA甲基化比例，而PCDH7 在各年龄段膀胱癌患者中均表现出较高的DNA 甲基化比例，且正是这些PcG 复合物吸引DNMT，使一些细胞在发育早期便出现DNA 异常甲基化。NMIBC 的进展与细胞周期阻滞、转录、细胞黏附、细胞凋亡和细胞分化等过程的相关基因甲基化有关，而MIBC 的低生存率则与CDH1、FHIT、LAMC2、RASSF1A、TIMP3、SFRP1、SOX9、PMF1 和RUNX3 基因的甲基化有关[17]。由于膀胱肿瘤直接与尿液接触，肿瘤细胞中DNA 甲基化状态可以通过尿液检测得到反馈。以上结果提示，DNA 甲基化相关尿液生物标志物是膀胱癌的一个有力标志物。

2 DNA 甲基化相关尿液生物标志物用于膀胱癌早期诊断

DNA 甲基化等表观遗传学修饰过程发生在DNA转录之前，这给膀胱癌的早期诊断提供了可能。80%～90%的膀胱癌患者以血尿为首发症状[2]，然而仅一部分血尿患者被确诊为膀胱癌，这意味着相当数量的血尿患者经历了不必要的膀胱镜检查。因此，在早期诊断与血尿患者筛查方面，DNA 甲基化相关尿液生物标志物检测举足轻重。

最近，中国科学院北京基因组研究所通过计算尿液样本中每个甲基化单倍体模块的甲基化单倍型负荷，用LASSO 回归分析获得差异最显著的DNA 甲基化标志物，根据最佳权重整合支持向量机算法构建的拷贝数变异模型，开发了一种集成分类器UCseek。UCseek 在验证集中的灵敏度和特异度分别为92.7%和90.7%，总体准确度远胜于荧光原位杂交检测和尿液脱落细胞学检测；它在低级别尿路上皮癌和Ta/T1期患者中具有很高的准确度（91.8%和94.3%），超低测序深度（0.3×～0.5×）下表现保持良好，证明其能早期且高效发现膀胱内尿路上皮癌的存在[18-19]。Cheng 等[20]对尿液cfDNA 进行浅深度双端全基因组测序后评估甲基化反褶积、全局低甲基化、拷贝数变异和cfDNA，结果发现NDA 甲基化和拷贝数联合检测膀胱癌的灵敏度为93.5%（低级别非肌层浸润性疾病为84.2%），特异度为95.8%。Zhang 等[21]通过检测尿液样本，构建了一种基于NRN1 单基因甲基化结合TERT 与FGFR3 双基因点突变的检测模型，在外部验证集中灵敏度为86.4%，特异度为89.5%。Xu 等[22]通过亚硫酸氢盐特异性qRTPCR 进行ONECUT2 CpG 位点的DNA 甲基化分析，结合基于多重PCR 的二代测序分析Genetron health 17 基因组合的突变情况，在血尿患者队列中验证灵敏度为94.0%，特异度为93.1%，阳性预测值为92.2%，阴性预测值为94.7%。Guo 等[23]使用甲基化特异性PCR 检测了473 例受试者（包括217 例膀胱内尿路上皮癌患者）尿液样本中10 个基因的甲基化状态，经过组合与计算发现使用VIM、RASSF1A、GDF15 和TMEFF2 的甲基化状态组合可以使诊断膀胱癌的灵敏度达到82%，特异度达到53%。

中山大学孙逸仙纪念医院的黄健/林天歆团队在DNA 甲基化检测技术utMeMA 的基础上研发出了尿液DNA 甲基化诊断膀胱癌产品UriFind，同时对本院患者队列、癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）队列和GEO 队列的膀胱癌测序数据进行联合分析，先鉴定出26 个膀胱癌显著差异和特异性的DNA 甲基化位点，然后通过相关分析和LASSO 回归确定ONECUT2 与VIM作为检测位点[24-25]。UriFind 在训练集和验证集中均可精准识别出膀胱癌患者，且其灵敏度和准确度均超过荧光原位杂交和尿细胞学检查；但需要注意的是，UriFind 在伴有泌尿系统影像学异常的膀胱癌疑似患者队列中的阳性预测值较高（92.9%），说明其有利于膀胱癌的早期发现、早期诊断、早期治疗；而在血尿患者筛查时，其阴性预测值高达97.6%，说明Urifind 可以为血尿患者避免不必要的膀胱镜检查[24-25]。相似的，已通过美国FDA 临床实验室自建项目（laboratory developed test，LDT）认证的AssureMDx 结合了甲基化特异性PCR 和多重SNaPshot，在血尿患者中的总体阴性预测值高于99%，可排除无需进一步检查的血尿患者，从而减少首诊过程中77%不必要的膀胱镜检查[26]。关于评估AssureMDx 对血尿患者膀胱癌检出能力的临床试验NCT03122964 已在美国进行中。另一通过LDT 认证的检测方法Bladder CARETM，采用无亚硫酸氢钠的MSRE-qPCR 法检测SOX1、IRAK3 和LINE1 的DNA 甲基化状态，由于减少了对DNA 样品的损耗而取得了较低的检测下限，甚至可检出浓度仅为0.046%的膀胱癌细胞DNA，这对于肿瘤的早期发现意义重大[27]。

UroMark 由英国伦敦大学研发，其研究人员结合标本全基因组甲基化测序与TCGA 数据库的分析结果，通过随机森林模型分析确认了150 个差异甲基化区域（differentially methylated region，DMR），并使用RainDropBS-Seq 分析检测尿液DNA 中的150 个DMR。在274 例血尿患者组成的验证队列中，UroMark 的灵敏度和特异度分别达到98%和97%，阴性预测值为97%[28]。它的效能将在2 项前瞻性、多中心的观察性研究中得到进一步评估，其中DETECTⅠ（临床试验NCT02676180）评估了UroMark 在血尿患者中排除膀胱肿瘤的阴性预测能力，DETECT Ⅱ（临床试验NCT02781428）评估了UroMark 在新发或复发患者中检测膀胱肿瘤的灵敏度，但上述研究结果仍未发布。

3 DNA 甲基化相关尿液生物标志物用于膀胱癌复发监测

NMIBC 患者存在着较高的复发和进展风险，因此需要在治疗后接受长期甚至终身的随访[2，5]。在此过程中，反复的膀胱镜检查会给患者带来痛苦和心理负担。因此，利用DNA 甲基化相关尿液生物标志物补充或代替部分膀胱镜检查是十分必要的。

以色列Nuclexi 公司推出的Bladder Epicheck 通过RT-PCR 检测基因组中15 个位点的DNA 甲基化。在欧洲一项多中心、前瞻性临床试验（NCT02647112）中，Bladder Epicheck 被用于检测440 例膀胱癌的患者的NMIBC 复发风险，结果显示其可以有效预测复发（灵敏度为67%，特异度为88%，阴性预测值为94%），且对高级别肿瘤复发的监测更为灵敏；决策曲线分析显示其可使患者减少不必要的膀胱镜检查和细胞学检查[29]。Kandimalla 等[30]将尿液中OTX1、ONECUT2 与OSR1 的DNA 甲基化与FGFR3 突变状态结合，其监测复发性NMIBC 的灵敏度和特异度分别为79%和77%。许多在膀胱癌早期诊断中得到应用的检测方法亦可用于膀胱癌术后监测。在42 例患者组成的随访队列中，UCseek 监测小病灶复发的准确度为90.91%，明显高于膀胱镜检查的59.09%，这说明其能有效监测术后残留和复发，有利于膀胱癌的疾病管理[18]。国内正在进行的一项多中心、前瞻性临床试验（ChiCTR2200063932）将通过分析入组膀胱癌患者术后随访阶段的数据来明确UCseek 对膀胱肿瘤复发的监测及预测效能。Bladder CARETM在90 例经尿道膀胱肿瘤电切除术后随访的患者队列中取得了86%的灵敏度和89%的特异度，成功预测了80%的患者肿瘤复发，优于细胞学检查的35%和膀胱镜检查的15%[31]。Deng 等[32]在分析TCGA 数据与大型病例对照研究的基础上，选择DMRTA2 甲基化作为单靶点标志物，在验证集中检出膀胱癌的总体灵敏度为82.9%，特异度为92.5%，对膀胱癌复发的检出率为80.0%。

综上所述，在NMIBC 治疗后的随访中，DNA 甲基化相关尿液生物标志物检测在发现复发病灶方面具有接近膀胱镜检查的灵敏度和较高的阴性预测值，期待这些检测方法的联合应用能减少甚至替代部分膀胱镜检查。但针对不同危险分层的NMIBC 的不同随访方案，现有研究未作进一步细化；且目前仍无有效的DNA 甲基化相关尿液生物标志物被用于MIBC 术后的随访与复发监测。

4 DNA 甲基化相关尿液生物标志物用于膀胱癌危险分层

指南推荐对于低危NMIBC、高危NMIBC 与MIBC患者采取不同的治疗方式，不同危险程度膀胱癌的随访措施也有所不同[2，5]。已有研究表明，NMIBC 与MIBC 具有差异化的DNA 甲基化特征，膀胱癌组织中不同的DNA 甲基化改变也与膀胱癌的谱系和恶性程度密切相关[33-34]。因此，通过DNA 甲基化相关尿液生物标志物检测早期明确膀胱癌的风险等级对患者的治疗及随访具有指导意义。

武汉大学中南医院泌尿外科王行环团队在前期研究中发现且定位了17 个膀胱癌相关DMR，并在此基础上建立了一种针对特异性DNA 甲基化特征的靶向测序分析方法，将DNA 甲基化单倍体型分为T1DMR（来自肿瘤祖细胞的可遗传的细胞类型特异性DNA 甲基化）和T2DMR（肿瘤发生过程中的DNA 甲基化从头合成）后进行分层聚类分析。在多中心前瞻性临床验证队列中以双盲方式对259 份尿液样本进行检测，模型预测产生的数值结果（基底型/管腔型肿瘤评分）可准确地区分MIBC 与NMIBC，且与肿瘤的WHO 分级密切相关；术前尿液肿瘤评分可以将患者区分为低风险组和高风险组，术后尿液肿瘤评分可以预测患者的进展风险[34-35]。

Chen 等[25]开发的甲基化检测技术utMeMA，通过MassARRAY 方法基于检测OTX1 与SOX1-OT 两位点的甲基化状态计算得到尿液诊断评分，它与膀胱癌的分期分级与数量大小呈正相关，可反映肿瘤的恶性程度和肿瘤负荷，帮助医患作出诊疗决策。同一团队在UriFind 的基础上添加了3 个甲基化指标（OSTM1、SLC4A10、AC092805.1），构成了一个5 种标志物分层模型，在98 例膀胱癌疑似患者伴随泌尿系统成像异常患者组成的队列中，以90.5%的灵敏度和86.8%的特异度识别出了高风险的膀胱癌（高危NMIBC 和MIBC）患者[24]。

5 小结

近年来，许多DNA 甲基化相关尿液生物标志物在世界范围内得到广泛临床应用，这样多位点、大范围的应用证明了其优越性。部分DNA 甲基化相关尿液生物标志物应用概况见表1[18，24-28，36-38]。

表1 部分DNA 甲基化相关尿液生物标志物应用概况

DNA 甲基化本身是一种相对稳定存在的生物学标志，可以被精确量化并比较；在上述许多研究中，尿液中DNA 的甲基化状态被证明为不受其他尿路良性病变影响，也与患者的具体临床特点无关。这都说明了DNA 甲基化作为检测位点的优越性。作为一种液体活检策略，DNA 甲基化相关尿液生物标志物在膀胱癌诊治过程中的应用具有其他检测方式不具备的优点。便捷、无创的操作可以减轻患者的生理及心理负担，提升膀胱癌患者在整个疾病管理过程中的依从性，有利于在早期筛查或复发监测过程中进行反复检查，也为偏远地区的患者提供了更具有可及性的辅助检查手段。而较高的阴性预测值可以为患者减少不必要的膀胱镜检查，减少人力及经济损耗。由于诊断偏倚，在DNA 甲基化相关尿液生物标志物检测呈阳性而进行的后续膀胱镜检查过程中，尿路上皮癌检出率会显著提高[39]。但这类诊断方法仍然存在着一些不足。许多DNA 甲基化相关尿液生物标志物都展现出较高的灵敏度，但是其特异度的表现不尽如人意。部分假阳性可能是由于在患者出现膀胱癌的症状、体征和实体肿瘤之前，形态学正常的尿路上皮细胞中已发生了相关基因的DNA 甲基化，因此需要对“健康队列”进行长期随访，以进一步明确其状态[40]。此外，许多尿液生物标志物检测在可重复性上并不理想，这归因于肿瘤异质性，也可能是受制于医生对患者状态的选择与检测程序的复杂性[5，41]。将DNA 甲基化相关尿液生物标志物作为膀胱癌诊断标志物的基础研究和实用产品数量众多，但仍有许多尚未经随机对照临床试验证实，今后仍需更大的验证队列、更长的随访时间作进一步验证，这也意味着众多基础研究成果的临床转化需要巨大成本。

需要注意的是，虽然指南列入了部分DNA 甲基化尿液生物标志物作为诊断与随访手段的补充，但膀胱镜检查仍是目前膀胱癌诊断与复发监测的金标准[40，42]。

6 展望

除了上文所述的疑诊患者诊断分层和术后患者定期随访，临床上也可以利用DNA 甲基化相关尿液生物标志物在高危人群（吸烟等）和职业暴露者（如接触芳香胺、多环芳烃和氯化烃等化学试剂的从业人员）中进行筛查，这将有助于对膀胱癌患者的早诊早治，降低膀胱癌的死亡率与疾病负荷。

在精准医疗时代，以DNA 甲基化为基础的膀胱癌诊治策略显得尤为重要。二代测序技术已广泛应用于临床，三代测序技术也在不断优化，随着基础研究的不断进步，越发全面地揭示DNA 甲基化的生物学特征以及其与肿瘤的联系。这预示着DNA 分子水平的诊断技术将不断精进，膀胱癌分子分型体系将不断完善，包括DNA 甲基化在内的许多与肿瘤致病机制相关的遗传物质位点将被发现，而这些位点都可以成为膀胱癌精准诊断与治疗的靶标。结合阿扎胞苷、地西他滨等DNA 去甲基化药物，医疗机构可以更高效地为膀胱癌患者提供个体化的DNA 甲基化抑制策略；虽还未应用至临床，但此类逆转DNA 甲基化的治疗已在一些基础研究中得到证实[43-45]。

Agundez 等[46]、Allen 等[47]发现，特定基因的DNA 甲基化状态可用于预测T1期高级别膀胱癌患者对卡介苗膀胱灌注治疗的反应性，从而进一步指导相关治疗策略。Li 等[48]通过聚类分析确定的Methy-High 亚群膀胱癌细胞对DNMT 抑制剂SGI-110 具有更灵敏的反应。Jarmalaite 等[49]发现p16 基因高DNA 甲基化的膀胱癌患者对IL-2 的治疗反应较好。Hu 等[50]基于5-甲基胞嘧啶调控因子开发了一个分子亚型系统，以全面反映膀胱癌的生物学特征，其中5-甲基胞嘧啶评分较高组对免疫治疗、新辅助化疗和放疗的敏感性较低，但对抗血管生成疗法和靶向治疗的敏感性较高。先前有研究发现DNMT 抑制剂可以通过IFN-Ⅰ反应促进肿瘤浸润免疫细胞聚集，进而逆转DNA 异常甲基化造成的免疫检查点抑制剂耐药[51]。许多研究发现，DNA甲基化水平与膀胱肿瘤细胞对化疗的敏感性相关[47，52-60]；但Taber 等[61]通过多组学分析发现DNA 甲基化簇与MIBC 的化疗反应之间无明显关联，Casadevall等[62]总结包括DNA 甲基化在内的表观遗传学改变对膀胱癌患者预后的影响尚不清楚。因此，DNA 甲基化相关尿液生物标志物对膀胱癌治疗与长期管理的指导作用仍有待进一步研究明确。

继Conrad Waddington 在1957 年提出“沃丁顿表观遗传景观”的概念以描述细胞发育分化的状态后，发育生物学领域的学者们逐渐开始运用数学建模模拟这一过程。Feinberg 等[63]在此观点的基础上进行了拓展，提出可以通过数学建模联系癌症的表型可塑性与驱动癌症的表观遗传变化。期待此方法用于定量描述膀胱癌细胞基因组中的DNA 甲基化水平，从而直接、细致地分类并量化膀胱癌致病过程中的表观遗传学异常，探寻其与癌症表观遗传景观和行为特征的关系，在临床前阶段更精准、有效地作出膀胱癌的早期诊断与预后评估，并在此基础上进行更有针对性的早期干预。

尽管存在一些缺陷与挑战，不可否认的是DNA 甲基化相关尿液生物标志物具有其独特的优势和实用价值，在膀胱癌诊治中的应用前景值得肯定。

（本文由浙江省医学会推荐）