木犀草素介导PERK/eIF2α/CHOP信号通路改善新生大鼠坏死性小肠结肠炎的作用研究

章捷 田由 吴臻斐 黄玲莉

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是一种以肠道炎症为主要特征的严重胃肠道疾病，多发于新生儿，尤其在早产儿、低体重儿中的发病率更高，是导致新生儿死亡的重要原因之一[1-2]。NEC 发病机制复杂。大量研究表明，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介导的细胞凋亡与NEC 病程发展密切相关，其中蛋白激酶RNA 样内质网激酶（protein kinase RNA- like endoplasmic reticulum kinase，PERK）/真核翻译启动因子2α（eukayotic translation initiation factor 2α，eIF2α）/CCAAT 增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）信号通路是ERS 诱导肠道上皮细胞凋亡的重要途径，而抑制该通路可以改善肠道损伤，延缓NEC 的发病进程[3-4]。因此，有效调控PERK/eIF2α/CHOP 信号通路或许能为治疗NEC 的新药研发提供思路。木犀草素是一种具有抗炎和免疫调节作用的黄酮类化合物，能有效减轻NEC 模型大鼠肠道黏膜损伤，对肠黏膜有保护作用[5-6]。木犀草素还能通过激活PERK、eIF2α、活化转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）、CHOP 等ERS 相关蛋白，进而诱导人胶质母细胞瘤细胞凋亡[7]。但木犀草素能否通过调控PERK/eIF2α/CHOP 信号通路改善NEC，目前尚不明确。因此，本研究通过建立NEC 大鼠模型和NEC 细胞模型，从大鼠体内外水平观察木犀草素对NEC 的影响以及对PERK/eIF2α/CHOP 信号通路的调控作用，进而探讨木犀草素改善NEC 的可能机制，为临床应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物和细胞 无特定病原体的清洁级新生SD 大鼠30 只，雌雄不限，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。大鼠小肠上皮细胞系IEC-6（批号：iCell-r016）购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。本研究经浙江鹰旸医药研发有限公司实验动物伦理委员会审查通过（批准文号：ZJEY-20221128-06）。

1.2 主要试剂与仪器 木犀草素（粉剂；规格：100 mg/瓶；批号：B20888）、PERK 抑制剂GSK2606414（粉剂；规格：25 mg/瓶；批号：S80279）、4'，6-二脒基-2 苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（批号：S19119）均购自上海源叶生物科技有限公司；苏木素（批号：20220425）、伊红（批号：20220417）均购自美国Sigma公司；噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）试剂盒（批号：117831320226）、原位末端转移酶标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）试剂盒（批号：11222220513）、BCA 定量试剂盒（批号：120219200721）均购自上海碧云天生物技术有限公司；大鼠TNF-α ELISA 试剂盒（批号：202211）购自泉州市睿信生物科技有限公司；大鼠IL-6 ELISA 试剂盒（批号：864895-008）购自美国Thermo公司；PERK抗体（批号：23M5315）、磷酸化PERK（p-PERK）抗体（批号：87p8121）、eIF2α抗体（批号：55h2355）、磷酸化eIF2α（p-eIF2α）抗体（批号：83H9328）、CHOP 抗体（批号：55Y1643）均购自美国Affinity 公司。Micro17R 低温高速离心机、BB150细胞培养箱均购自美国Thermo 公司；TP1020 脱水机、RM2235 病理切片机均购自上海徕卡仪器有限公司；BMJ-IB 包埋机购自天津天利航空机电有限公司；Nikon Eclipse Ci-L 正置光学显微镜购自日本Nikon 公司；AE2000 光学显微镜购自中国Motic 公司；610020-9Q 化学发光仪购自上海勤翔科学仪器有限公司；BX63 电动荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.3 动物实验

1.3.1 动物建模、分组与处理 （1）NEC 新生大鼠模型建立：取24 只新生大鼠置于含100%氮气的缺氧箱中90 s 后立即取出，置于4 ℃冰箱中10 min，每12 h 进行1 次上述缺氧冷刺激，连续3 d，建立NEC 新生大鼠模型[8]。（2）动物分组：将建模后的新生大鼠按随机数字表法分为木犀草素17.5 mg/kg 组、木犀草素35 mg/kg组、木犀草素70 mg/kg 组、模型组，每组6 只；剩余6 只新生大鼠设为正常组。（3）动物处理：用药的3 组新生大鼠分别予相应剂量的木犀草素（均溶于0.1 mL 0.9%氯化钠溶液中），其余两组新生大鼠仅予0.1 mL 0.9%氯化钠溶液，均灌胃1 次/d，连续4 d。5 组新生大鼠均在笼中鼠乳喂养，于第5 天予二氧化碳安乐死处理，采集大鼠眼眶血备用，剖腹取结肠组织备用。

1.3.2 大鼠肠道组织病理学变化观察 采用HE 染色。取大鼠肠道组织，4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，5 μm 切片，脱蜡水合，HE 染色。在正置光学显微镜观察采集大鼠肠道组织病理学变化并采集图片。

1.3.3 大鼠肠道组织细胞凋亡检测 采用TUNEL法。取大鼠肠道组织，切成5 μm 薄片，烤片30 min，脱蜡水化。滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K，在37 ℃下处理30 min。甩干后使用PBS配置的0.1%Triton在室温下孵育组织样本20 min。随后滴加TdT酶、dUTP、buffer，置于37 ℃恒温箱孵育2 h。使用PBS洗涤3次，5 min/次。移除PBS后滴加DAPI染液，置于避光室温下孵育10 min。使用抗荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜下观察结果，利用Image-Pro Plus 6.0软件计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=（TUNEL阳性细胞数/观察细胞总数）×100%。

1.3.4 大鼠肠道组织及血清中TNF-α、IL-6 水平检测 采用ELISA 法。（1）取大鼠肠道组织，PBS 冲洗，剪碎，制备组织匀浆，6 711 r/min 离心5 min，取上清液检测大鼠肠道组织中TNF-α、IL-6 水平。（2）取大鼠眼眶血，3 500 r/min 离心15 min，取上清液检测大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平。

1.3.5 大鼠肠道组织PERK/eIF2α/CHOP 信号通路相关因子表达水平检测 采用Western blot 法。根据试剂盒提示步骤提取大鼠肠道组织蛋白，采用BCA 法测定样品浓度，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜上，封闭，孵育1.5 h，洗膜，加入一抗（PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP），4 ℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育1 h，洗膜。在暗室中曝光显影，使用Quantity One 凝胶分析软件测定蛋白条带灰度值，计算p-PERK 与PERK、p-eIF2α 与eIF2α、CHOP 与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）条带灰度值的比值。

1.4 细胞实验

1.4.1 细胞建模与分组 （1）NEC 细胞模型建立：将大鼠肠上皮细胞系IEC-6 置于100 μg/mL 脂多糖溶液中刺激3 h[9]。（2）细胞分组：①将建模后的IEC-6 细胞接种于6 孔板，细胞浓度设为1×106个/孔，按随机数字表法分为木犀草素5 μmol/L 组、木犀草素10 μmol/L组、木犀草素20 μmol/L 组、模型组，另取未行脂多糖处理的IEC-6 细胞设为正常组（仅予0.9%氯化钠溶液），使用移液枪分别加入相应药物后，均在37 ℃、95%O2+5%CO2的细胞培养箱中培养24 h。②另取建模后的IEC-6 细胞接种于6 孔板，细胞浓度设为1×106个/孔，分为GSK2606414 0.5 μmol/L 组、GSK2606414 1.0 μmol/L 组、GSK2606414 2.0 μmol/L 组、GSK2606414 4.0 μmol/L 组、模型组（仅予0.9%氯化钠溶液），使用移液枪分别加入相应药物后，于细胞培养箱中培养24 h。以上实验每组设3 个复孔，结果取平均值。

1.4.2 IEC-6 细胞存活率检测 采用MTT法。取各组IEC-6 细胞制备成细胞悬液，经不同浓度木犀草素或GSK2606414干预处理后，加入10 μL MTT溶液培养2 h；使用酶标仪测定波长450 nm 处的吸光度值，计算细胞存活率。后续细胞实验选择细胞存活率最高的药物浓度（木犀草素20 μmol/L，GSK2606414 4.0 μmol/L）作为干预浓度，增设木犀草素20 μmol/L+GSK2606414 4.0 μmol/L 组。

1.4.3 IEC-6 细胞中TNF-α、IL-6 水平检测 采用ELISA法。取IEC-6细胞培养液，2 000～3 000 r/min离心20 min，取上清液检测IEC-6细胞中TNF-α、IL-6水平。

1.4.4 EC-6 细胞中PERK/eIF2α/CHOP 信号通路相关因子表达水平检测 采用Western blot 法。根据试剂盒提示步骤提取EC-6 细胞总蛋白，后续步骤与1.3.5所描述的基本相同。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0 统计软件和Graph-Pad Prism 9.0 软件。计量资料以表示，若方差齐时多组间比较采用单因素方差分析的Tukey 检验，若方差不齐多组间比较采用Dunnett'sT3检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 木犀草素对NEC 大鼠肠道组织病理学变化的影响 正常组大鼠肠道组织结构基本正常完整，无明显损伤；模型组、木犀草素17.5 mg/kg 组大鼠肠道组织绒毛脱落严重，黏膜下层和（或）固有层严重分离，组织损伤严重；木犀草素35 mg/kg组大鼠肠道组织绒毛脱落分离，组织轻微损伤；木犀草素70 mg/kg 组大鼠肠道组织结构较为完整，绒毛轻微分离，组织损伤较小，见图1。

图1 木犀草素对坏死性小肠结肠炎大鼠肠道组织病理学变化的影响

2.2 木犀草素对NEC 大鼠肠道组织细胞凋亡率的影响 与正常组比较，模型组大鼠肠道组织细胞凋亡率明显较高（P＜0.05）；与模型组比较，木犀草素17.5 mg/kg 组、木犀草素35 mg/kg 组、木犀草素70 mg/kg组大鼠肠道组织细胞凋亡率均明显较低（均P＜0.05），见图2（封三）。

图2 木犀草素对坏死性小肠结肠炎大鼠肠道组织细胞凋亡率的影响

2.3 木犀草素、GSK2606414 对IEC-6 细胞存活率的影响 木犀草素5 μmol/L 组、木犀草素10 μmol/L 组、木犀草素20 μmol/L 组、模型组、正常组细胞存活率分别为（53.29±3.59）%、（68.70±4.55）%、（83.42±6.39）%、（43.39±2.80）%、（100.00±6.35）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中模型组细胞存活率较正常组明显下降（P＜0.05），木犀草素5 μmol/L 组、木犀草素10 μmol/L 组、木犀草素20 μmol/L 组细胞存活率均较模型组明显升高（均P＜0.05），且以木犀草素20 μmol/L组最高（均P＜0.05）。GSK2606414 0.5 μmol/L组、GSK2606414 1.0 μmol/L 组、GSK2606414 2.0 μmol/L组、GSK2606414 4.0 μmol/L 组、模型组细胞存活率分别为（66.72± 6.44）% 、（74.61± 7.39）% 、（80.15±7.42）%、（85.57±7.51）%、（52.52±5.17）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中GSK2606414 0.5 μmol/L 组、GSK2606414 1.0 μmol/L 组、GSK2606414 2.0 μmol/L 组、GSK2606414 4.0 μmol/L 组细胞存活率较模型组均明显升高（均P＜0.05），且以GSK2606414 4.0 μmol/L 组最高（均P＜0.05）。故后续细胞实验选择细胞存活率最高的药物浓度（木犀草素20 μmol/L，GSK2606414 4.0 μmol/L）作为干预浓度。

2.4 木犀草素对NEC 大鼠肠道组织、血清及IEC-6 细胞中TNF-α、IL-6 水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠肠道组织及血清中TNF-α、IL-6 水平均明显较高（均P＜0.05）；与模型组比较，木犀草素35 mg/kg 组、木犀草素70 mg/kg 组大鼠肠道组织中TNF-α、IL-6 水平明显较低（均P＜0.05），木犀草素17.5 mg/kg 组、木犀草素35 mg/kg 组、木犀草素70 mg/kg 组大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平均明显较低（均P＜0.05），见表1。与正常组比较，模型组IEC 细胞中TNF-α、IL-6 水平均明显较高（均P＜0.05）；与模型组比较，木犀草素20 μmol/L 组IEC 细胞中TNF-α、IL-6 水平均明显较低（均P＜0.05），见表2。

表1 木犀草素对坏死性小肠结肠炎大鼠肠道组织及血清中TNF-α、IL-6 水平的影响（ng/L）

表2 木犀草素对IEC-6细胞中TNF-α、IL-6水平的影响（ng/L）

2.5 木犀草素对NEC 大鼠肠道组织及IEC-6 细胞中PERK/eIF2α/CHOP 信号通路相关因子表达水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠肠道组织中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP 表达水平均明显较高（均P＜0.05）；与模型组比较，木犀草素17.5mg/kg组、木犀草素35mg/kg组、木犀草素70mg/kg组大鼠肠道组织中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平均明显较低（均P＜0.05），见图3A。与正常组比较，模型组IEC-6细胞中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平均明显较高（均P＜0.05）；与模型组比较，木犀草素20μmol/L组IEC-6细胞中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平均较低（均P＜0.05）；与木犀草素20μmol/L组比较，木犀草素20μmol/L+GSK26064144.0μmol/L组IEC-6细胞中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP表达水平均明显较低（均P＜0.05），见图3B。

3 讨论

NEC 发病机制较为复杂，早期以肠道炎症为主要特征，随疾病发展，可导致小肠上皮细胞凋亡、坏死，严重时可引发多器官衰竭和全身脓毒血症，最终造成死亡[10-11]。因此，抑制肠道炎症、减少小肠上皮细胞凋亡对于有效治疗NEC 尤为重要。但目前对于NEC 的治疗方法以外科手术治疗和内科保守治疗为主，前者易导致多种并发症，后者往往疗效不佳且不良反应较多，目前尚无统一有效的临床治疗措施[12-13]。本研究使用的木犀草素源于多种药用植物的活性成分，具有抗炎和调节免疫的生物活性，可有效改善NEC 模型大鼠肠道损伤，缓解其发病进程[5-6]。相关研究表明，木犀草素具有减轻组织损伤、减少细胞凋亡和增强细胞活性的作用[14]。本研究以缺氧冷刺激法建立NEC 大鼠模型，HE 染色结果显示，与模型组比较，木犀草素35 mg/kg 组、木犀草素70 mg/kg 组大鼠肠道组织绒毛分离减少，组织损伤明显改善，这说明木犀草素对肠道组织结构和功能具有显著改善作用。TUNEL 染色结果显示，与模型组比较，不同浓度木犀草素干预后的NEC 大鼠肠道组织细胞凋亡率均明显下降，说明木犀草素可抑制肠道组织细胞凋亡。同时，本研究采用脂多糖刺激法建立NEC 细胞模型，MTT 结果显示，与模型组比较，木犀草素5 μmol/L 组、木犀草素10 μmol/L 组、木犀草素20 μmol/L 组IEC 细胞存活率均明显升高，其中木犀草素20 μmol/L 组作用最显著，说明木犀草素能够提高小肠上皮细胞存活率。以上研究结果与Vukelic 等[14]研究结果相符。

炎症反应在NEC 的发生、发展中起着关键作用。多项研究表明，TNF-α、IL-6 水平与NEC 早期诊断和预后评估有关[15]。TNF-α 是体内重要的核转录调节因子，在感染、腹泻等多种应激源的诱导下转导到细胞核中，可介导多种信号转导通路，参与炎症反应和免疫反应[16]。Schreurs 等[17]研究表明，胎儿CD4 效应记忆T 细胞可通过分泌TNF-α 细胞因子在生命早期介导严重的细胞炎症，进而引发NEC。IL-6 是人体重要的促炎介质，能诱导许多炎症细胞和炎症介质的释放，是导致炎症级联反应和平衡障碍的关键因素之一。Guo等[18]研究表明，IL-6 水平与肠道生理和病理状态密切相关。本研究结果显示，与模型组比较，经不同浓度木犀草素干预处理后的NEC 大鼠肠道组织、血清以及IEC 细胞中TNF-α、IL-6 水平均明显下降，说明木犀草素可通过抑制炎症介质TNF-α、IL-6 的释放来减轻组织炎症，进而延缓疾病进程，这可能与木犀草素能够通过调控促炎介质、调节促炎基因表达以及调节炎症小体发挥抗炎作用等有关[19]。

ERS 是机体面对多种刺激因素和损伤因子进行适应环境的自我调整，在NEC 的发病过程中发挥关键作用，其增加会引起小肠上皮细胞凋亡或坏死，最终导致NEC 的发生[20]。当发生ERS 时，内质网通过未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）维持其正常功能并促进细胞存活，但是如果刺激过强或持续过久，UPR 不能恢复内质网的稳态，则会启动凋亡途径，损害组织器官[20]。PERK/eIF2α/CHOP 信号通路是ERS诱导细胞凋亡的重要通路之一。研究发现，当内质网中存在较多未折叠蛋白时，葡萄糖调节蛋白会与PERK 分离，从而激活PERK，随后eIF2α 通过磷酸化阻断蛋白质合成，但持续的应激会增加ATF4 的翻译，促进CHOP 的表达，进而激活PERK/eIF2α/CHOP 信号通路，介导细胞凋亡[3-4，21]。本研究MTT 结果显示，与模型组比较，给予GSK2606414 干预后的IEC 细胞存活率明显升高，其中GSK2606414 4.0 μmol/L 组作用最显著，提示抑制PERK 蛋白可提高小肠上皮细胞活性，木犀草素可能通过调控PERK 蛋白来减少细胞凋亡，并增加细胞活性。Western blot 检测结果显示，与模型组比较，经木犀草素干预处理后的NEC 大鼠肠道组织、血清以及IEC 细胞中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP 表达水平均明显降低，而加入GSK2606414 后木犀草素对PERK/eIF2α/CHOP 信号通路的抑制作用进一步加强，进一步说明木犀草素可通过抑制PERK/eIF2α/CHOP 信号通路来减少NEC 肠道组织细胞的凋亡、坏死。

综上所述，木犀草素可有效改善新生大鼠NEC，其作用机制可能与下调TNF-α、IL-6 以及p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、CHOP 表达水平进而抑制炎症反应有关，这为临床NEC 的治疗提供理论参考。