基于网络药理学和分子对接技术探讨肾炎康复片治疗IgA肾病的作用机制

林雪萍 陈智鸿 滕 杰

复旦大学附属中山医院厦门医院肾内科，福建厦门 361015

IgA 肾病是全球最常见的原发性肾小球肾炎，是导致终末期肾衰竭的主要原因之一[1]。50%的患者在诊断后25 年内进展为终末期肾病，给家庭和社会带来沉重的负担[2]。目前仍缺乏特异性和有效的治疗策略。肾炎康复片已成为治疗IgA 肾病的常见中药制剂，具有益气养阴、补肾健脾、清解余毒等功效[3]，但肾炎康复片治疗IgA 肾病的机制尚未明确。本研究基于网络药理学探讨肾炎康复片治疗IgA 肾病的信号通路和作用靶点，通过分子对接分析验证，为肾炎康复片治疗IgA 肾病提供新证据。

1 材料与方法

1.1 肾炎康复片活性成分获取及其基因靶点预测

检索中药数据库TCMSP（https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和TCM-ID（https://bidd.group/TCMID/index.html），以同时满足口服吸收率≥30%和类药性≥0.18 为条件对肾炎康复片的活性成分及其对应的靶点信息进行检索，进一步使用Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）扩大检索，筛选Probability ≥0.2 的靶基因。使用UniProt数据库规范统一基因靶点名称格式。

1.2 IgA肾病靶基因获取

以“IgA nephropathy”为检索关键词，通过GeneCards（https://www.genecards.org/）、Disgenet（https://www.disgenet.org/）和OMIM（https://omim.org/）数据库，检索IgA 肾病相关人类基因，GeneCards 和Disgenet筛选条件分别设置为Relevancescored ≥1.0、Score ≥0.1，将以上3 个数据库获得的基因合并汇总并去除重复基因。

1.3 获取药物-疾病共同靶点基因

应用Venny 2.1.0 线上作图平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）对肾炎康复片活性成分靶点基因与IgA 肾病相关人类基因进行交集，筛选出共同靶点。

1.4 构建蛋白质-蛋白质互作（protein-protein interactions，PPI）网络图

将1.3 获得的药物疾病共同基因导入STRING（https://string-db.org/）数据库中，条件物种设置为“homosapiens”，相互作用阈值设置为最高置信度（highestconfidence）0.9，使用CytoScape 3.9.1 软件作靶点间网络分析，进行可视化处理。

1.5 构建“药物-活性成分-共同靶点”网络图

使用CytoScape 3.9.1 软件对肾炎康复片-活性成分-靶点网络作可视化展示，选取自由度（Degree）排名前十的药物成分为主要活性成分。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

将共同靶点导入Metascape（https://metascape.org/）网络在线平台，条件物种设置为“homosapiens”，获得生物学过程（biologicalprocess，BP）、细胞组成（cellularcomponent，CC）、分子功能（molecularfunction，MF）及KEGG 富集数据，剔除无关信号通路，利用bioinformatics 在线平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）作可视化展示。

1.7 构建“主要活性成分-靶点-信号通路”网络图

使用CytoScape 3.9.1 软件构建主要活性成分-靶点-信号通路网络图，分别选取Degree 值排名前五的药物成分和基因靶点，推测为肾炎康复片治疗IgA 肾病的关键成分和核心靶点。

1.8 关键成分与核心靶点的分子对接

分别从PuChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和PDB（https://www.rcsb.org/）数据库下载有效成分化合物结构和核靶点的蛋白分子结构，使用Pymol 软件去除水分子和小分子配体。经MGLTools-1.5.7 添加极性氢和电荷后作为受体，以有效成分化合物作为配体，运用AutoDock Vina 1.1.2 软件进行对接，选取结合能较小的构象为最优构象，使用Pymol 作可视化展示。

2 结果

2.1 肾炎康复片和IgA肾病主要靶点筛选结果

通过检索肾炎康复片化学成分，去除重复值，共有182 个活性成分，对其中TCMSP 数据库中17 个活性成分缺失的靶点信息使用Swiss Target Prediction 扩大检索，去除重复值后，得到310 个药物作用靶点。三个疾病数据库合并去除重复项后最终得到与IgA 肾病并联最强的1190 个靶点基因。绘制韦恩图，获得共有靶点119 个（图1）。

图1 肾炎康复片治疗IgA 肾病的药物-疾病共同靶点韦恩图

2.2 PPI网络和药物-活性成分-靶点网络

将119 个交集基因导入STRING 数据库，获得的数据运用CytoScape 绘制PPI 网络图（图2）和“药物-活性成分-共同靶点”网络图（图3），药物及活性成分用缩写作为标注，共有活性成分用字母A ～G 作为标注，筛选出Degree 值排名前十的主要活性成分为槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇、丹参酮IIA、柚皮素、花生四烯酸、金合欢素、异鼠李素（表1)。

表1 肾炎康复片中Degree值排名前10的主要活性成分

图2 肾炎康复片治疗IgA 肾病PPI 网络图

图3 肾炎康复片与IgA 肾病药物-活性成分-共同靶点网络图

2.3 GO功能分析和KEEG信号通路富集

将119 个基因进行BP、CC 和MF 富集，BP 排名前三的条目为细胞迁移正性调控、对脂多糖的反应、细胞运动的正调节，CC 排名前三的条目为膜筏、膜微区、囊泡腔，MF 排名前三的条目为细胞因子受体结合、细胞因子活性、DNA 结合转录因子结合（图4）。KEEG 信号通路富集结果显示肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase，PI3K/Akt）信号通路、白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信号通路、细胞衰老、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路排名靠前（图5）。

图4 肾炎康复片治疗IgA 肾病的潜在作用靶点的GO 分析

2.4 主要活性成分-靶点-信号通路网络

结合KEEG 信号通路富集结果，选取2.2 中10种主要活性成分，运用CytoScape 绘制主要活性成分-靶点-信号通路网络（图6）。Degree 值排名前五的主要活性成分为槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇，Degree 值排名前五的靶点基因为B 细胞淋巴瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2 gene，BCL2）、前列腺素过氧化物合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTSG2）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、胱天蛋白酶3（caspase3，CASP3）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，AKT1），推测为肾炎康复片治疗IgA 肾病的关键成分和核心靶点。

2.5 分子对接结果

选取Degree 值排名前五的主要成分化合物和核心靶点进行对接（表2）。槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇与核心靶点的结合能大部分都＜-5 kcal/mol，与核心靶点具有较高结合能力。其中豆甾醇与BCL2 和MAPK1、β-谷甾醇与MAPK1和CASP3 结合最优（结合能均＜-7 kcal/mol），对上述4 对分子对接构象作可视化展示（图7）。

表2 关键成分和核心靶点对接结合能以及氢键个数

图7 肾炎康复片关键成分和核心靶点分子对接构象图示意图

3 讨论

中医将IgA 肾病归于“肾风、尿血、尿浊、水肿、腰痛、虚劳”等范畴[4]。肾炎康复片的中药配伍遵循“益气养阴、补肾健脾、清解余毒”[5]，是治疗IgA 肾病的中医学理论基础。本研究借助网络药理学和分子对接方法探讨肾炎康复片治疗IgA 肾病机制。

分析获得肾炎康复片与IgA 肾病高度相关的119 个交集靶点。通过PPI 功能网，筛选出排名前十的主要活性成分。同时GO 和KEGG 富集显示肾炎康复片可通过多成分、多靶点、多通路治疗IgA 肾病。槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇等是肾炎康复片治疗IgA 肾病的主要活性成分。槲皮素具有抗氧化、抗炎等作用[6]，可抑制肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）等促炎因子的表达，调控哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路改善肾脏炎症损伤及肾间质纤维化[7]。β-谷甾醇具有抗氧化作用[8]。木犀草素可抑制肾小球基底膜增生[9]。山柰酚可减轻内皮细胞氧化应激和凋亡[10]。豆甾醇可发挥抗炎作用[11]。KEGG 富集结果显示涉及TNF、PI3K/Akt、IL-17、MAPK、细胞衰老等信号通路。结合KEFG 信号通路富集结果及肾炎康复片治疗IgA 肾病的主要活性成分进一步拓扑分析得到关键靶基因为BCL2、PTSG2、MAPK1、CASP3、AKT1，推测为肾炎康复片治疗IgA 肾病的核心靶点。BCL2 是可抑制细胞凋亡[12]。PTSG2 可被TNF-α、IL-1β 诱导引发炎症反应[13]。MAPK 是促进纤维化的重要信号通路[14]。CASP3 编码的Caspase-3 在急性肾损伤中发挥重要作用[15]。AKT1 通过调控细胞凋亡及自噬，参与IgA 肾病的调控[16]。将关键靶基因与肾炎康复片治疗IgA 肾病的药物活性成分进行分子对接均具有良好的结合能力。

综上所述，肾炎康复片可能通过槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、豆甾醇等多种成分，作用于BCL2、PTSG2、MAPK1、CASP3、AKT1，调控TNF、 PI3K-Akt、IL-17、细胞衰老和MAPK 等信号通路，调节炎症反应、细胞凋亡、自噬等途径，延缓IgA 肾病进展。