内质网膜蛋白4B对胃癌血管生成的影响

李 倩,王 珂,张慧敏

胃癌是常见的消化道肿瘤,患者5年生存率为18%左右[1]。胃癌细胞的增殖、侵袭是不良预后的主要原因,而新生血管会促进肿瘤侵袭和转移,因此寻找肿瘤血管生成的生物学机制并寻找潜在治疗靶点具有重要意义[2]。内质网膜蛋白4B(reticulon 4B,RTN 4B),又称为Nogo-B,是内质网膜蛋白4家族成员之一,在肝脏、卵巢、胃和血管等组织中均有表达,在细胞增殖、侵袭、凋亡、上皮间质转换和血管重构等病理生理学过程中发挥重要作用[3-5]。RTN 4B也会促进血管生成[6]。近年来发现,RTN 4B可能作为癌基因在卵巢癌和结直肠癌等发生发展中起到重要作用[5,7]。然而RTN 4B与胃癌的关系既往少有报道。为了探讨RTN 4B在胃癌中的作用,本研究检测RTN 4B在胃癌组织及胃癌细胞株中的表达,并分析沉默或过表达RTN 4B对胃癌血管生成的影响。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2023年1-3月在我院手术切除的胃癌组织及配对的癌旁组织(距离癌组织边缘>5 cm)各15例。其中男10例,女5例;年龄39～71岁,平均(54.90±7.10)岁。纳入标准:(1)病理学证实为胃癌;(2)术前未接受放化疗;(3)临床资料完整。排除标准:(1)合并其他部位肿瘤;(2)严重心肝肾功能异常;(3)免疫或代谢性疾病。

1.2 细胞与主要试剂 胃癌细胞系(AGS、NCI-N87、MGC803、BGC8231)和正常胃黏膜细胞系(GES-1)(上海冠导生物工程有限公司);人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC;上海晶诺生物科技有限公司);DMEM培养基、RPMI-1640培养基、Lipofectamine2000转染试剂(上海佰舜泰生物科技有限公司);兔抗人多克隆抗体RTN 4B、兔抗人单克隆抗体低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)、兔抗人多克隆抗体血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、兔抗人多克隆抗体GAPDH均购于英国Abcam公司;RTN 4B干扰质粒(RTN 4B siRNA)、RTN 4B过表达质粒(pcDNA3.1-RTN 4B)(上海吉玛制药技术有限公司);反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、凝胶快速制备试剂盒、免疫组化试剂盒(上海信裕生物科技有限公司);Matrix 基质胶(美国BD)。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色法检测胃癌组织及癌旁组织RTN 4B表达 标本经过脱蜡、水化处理,加入3%过氧化氢,去除内源性过氧化物酶,随后用柠檬酸修复液进行抗原修复。加入兔抗人多克隆抗体RTN 4B(1∶500),4 ℃孵育过夜,加入生物素标记的二抗,37 ℃孵育30 min。用DAB显色、苏木精复染、脱水、封片,显微镜下观察染色情况。

1.3.2 评分及标准 染色评分=染色强度评分×阳性细胞百分比评分。染色强度评分:阴性为0分,低表达为1分,中度表达2分,高表达3分;阳性细胞百分比评分:0%～5%为0分,6%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,76%～100%为4分。染色评分0～4分为低表达,5～12分为高表达[8]。

1.3.3 CD34标记的血管微密度(micro vessel density,MVD)检测 在低倍镜(×100)下观察血管密度最高处,随后高倍镜(×200)下观察计数血管[9]。以任何1个棕色染色的内皮细胞作为1个血管,管腔直径>8个红细胞和带有肌层的血管不予计数。随机取5个视野,观察微血管数,取平均数作为MVD值。

1.3.4 细胞培养及转染 取对数生长期胃癌细胞以1×106个/孔的密度接种于6孔板,用Lipofectamine 2000转染试剂分别将RTN 4B siRNA质粒(RTN 4B-siRNA组)和阴性对照质粒(CON组)转入AGS细胞,分别将RTN 4B过表达质粒(pcDNA3.1-RTN 4B组)和阴性对照质粒(pcDNA3.1-CON组)转入NCI-N87细胞,操作按照试剂盒说明书进行。

1.3.5 实时荧光定量PCR检测RTN 4B mRNA表达 收集胃癌细胞,用Trizol试剂提取总RNA。用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,以cDNA为模板进行PCR实验。反应条件为:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s、60 ℃退火延伸31 s,合计40个循环。以GAPDH作为内参,用2-ΔΔCt法计算RTN 4B表达水平。RTN 4B引物序列:上游5′-CGATAACTTGATGACC CCAGAA-3′;下游5′-ATAACGGCAAGATTCCATTTC-3′。GAPDH引物序列:上游5′-CGAT ACAGAGAAGATTAGCATGGC-3′;下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.6 Western-blot检测RTN 4B、HIF-1α、VEGF蛋白表达 收集胃癌细胞,加入蛋白裂解液提取蛋白。用BCA试剂盒检测蛋白浓度,加入蛋白20 μg/孔,用10%SDS-PAGE分离蛋白,随后将蛋白转至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1 h,加入RTN 4B抗体(1∶500)、HIF-1α抗体(1∶1000)、VEGF抗体(1∶500)或GAPDH抗体(1∶5000),4 ℃反应过夜。次日加入二抗,室温下反应1.5 h。用ECL发光仪成像,Image J软件分析灰度值。

1.3.7 血管生成实验 收集胃癌细胞,当细胞融合70 %时将RPMI-1640培养基换为DMEM培养基,培养48 h。收集胃癌细胞培养上清液,用0.22 μm滤器过滤。将HUVEC细胞用胃癌细胞培养上清液和新鲜培养基1∶1混合培养,当细胞融合度达80%时,用0.25 %胰酶消化。随后将细胞悬液接种于加有Matrigel基质胶的24孔板中。37 ℃、5% CO2条件下培养12 h。显微镜下观察细胞成像情况,随机取5个视野,对管长度和节点进行定量分析[10]。

2 结 果

2.1 RTN 4B在胃癌组织中的表达及其与MVD关系 免疫组化检测结果显示,癌组织RTN 4B高表达率为73.33%(11/15),高于癌旁组织[13.33%(2/15)];癌组织MVD高于癌旁组织[(28.06±3.05)vs.(21.70±5.26)],差异均有统计学意义(P<0.05,图1)。在癌组织中,高表达RTN 4B组织的MVD为(30.25±6.16),高于低表达组织(25.71±9.25),差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 胃癌组织免疫组化(×200)

2.2 RTN 4B在不同胃癌细胞株中的表达 胃癌细胞系(AGS、NCI-N87、MGC803、BGC8231)的RTN 4B基因及蛋白表达水平均高于正常胃黏膜细胞系(GES-1),差异有统计学意义(P<0.05,表1)。胃癌细胞系中AGS细胞的RTN 4B表达水平最高,而NCI-N87细胞最低(图2)。

表1 不同细胞株内质网膜蛋白4B表达水平比较

图2 Western-blot检测胃癌细胞系和正常胃黏膜细胞系内质网膜蛋白4B表达水平

2.3 过表达RTN 4B对NCI-N87细胞血管生成及相关蛋白表达的影响 pcDNA3.1-RTN 4B组RTN 4B基因和蛋白表达水平均高于pcDNA3.1-CON组(P<0.05,表2)。血管生成实验结果显示,pcDNA3.1-RTN 4B组管长度和节点均高于pcDNA3.1-CON组(P<0.05,图3)。

2.4 沉默RTN 4B对AGS细胞血管生成及相关蛋白表达的影响 RTN 4B-siRNA组RTN 4B基因和蛋白表达水平均低于CON组(P<0.05,表3)。血管生成实验结果显示,RTN 4B-siRNA组的管长度和节点高于CON组(P<0.05)。RTN 4B-siRNA组HIF-1α、VEGF蛋白表达水平均低于CON组(P<0.05,图4)。

图3 过表达RTN 4B对NCI-N87细胞血管生成及相关蛋白表达的影响

表2 过表达RTN4B对胃癌细胞血管生成及相关蛋白的影响

表3 沉默RTN4B对胃癌细胞血管生成及相关蛋白的影响

图4 沉默RTN 4B对AGS细胞血管生成及相关蛋白表达的影响

3 讨 论

在胃癌中,新生血管会促进肿瘤侵袭和转移,干预肿瘤血管生成会抑制肿瘤进展[11,12]。寻找肿瘤血管生成的生物学机制对胃癌的治疗有重要意义。本研究发现,RTN 4B在胃癌中高表达,能够促进胃癌血管生成,可能成为治疗靶点。

有研究发现,RTN 4B参与肿瘤发生发展[13]。RTN 4B通过RhoA-SRF-MRTFA通路促进鼻咽癌细胞侵袭和迁移[14]。Nogo-B与c-FLIP相互作用,通过抑制凋亡而促进结直肠癌细胞增殖和侵袭[5]。本研究发现,RTN 4B在胃癌组织和胃癌细胞系中表达水平升高,提示RTN 4B参与胃癌发生。然而RTN 4B参与胃癌进展的机制既往未见报道。肿瘤血管生成是肿瘤进展的重要原因,而此过程较为复杂,涉及内皮基质降解、内皮细胞增殖和形成新基底膜等[15-17]。Zheng等[4]发现,RTN 4B通过激活Notch1通路促进心肌梗死后的血管生成。在肝癌的研究中,RTN 4B可通过促进肿瘤血管生成而参与癌症进展[6]。CD34主要表达在血管内皮细胞[18],本研究检测CD34标记的血管微密度,结果发现胃癌组织MVD高于癌旁组织,差异有统计学意义。并且在癌组织中,高表达RTN 4B组织的MVD高于低表达组织,结果说明RTN 4B能够促进血管生成。

为进一步证实RTN 4B对胃癌血管生成的作用,本研究用Lipofectamine2000转染试剂分别将RTN 4B siRNA质粒和阴性对照质粒转入AGS细胞,分别将RTN 4B过表达质粒和阴性对照质粒转入NCI-N87细胞。结果显示,过表达RTN 4B促进胃癌血管生成,而沉默RTN 4B抑制血管生成。在低氧条件下,HIF-1α表达水平升高,进一步促进血管生成因子表达,进而参与肿瘤血管生成[19-21]。研究发现,上调RTN 4B促进HIF-1α表达,进而参与肝癌进展[22]。HIF-1α在促进血管生成的过程中,VEGF是关键细胞因子。VEGF促进肿瘤细胞增殖和侵袭,并可调节血管通透性[23-25]。本研究结果发现,过表达RTN 4B促进HIF-1α、VEGF表达,而沉默RTN 4B抑制HIF-1α、VEGF表达,进一步说明RTN 4B影响血管生成。

综上,RTN 4B在胃癌组织中高表达,并且能够促进胃癌血管生成。但本研究存在一些局限性,如未对胃癌患者进行随访,没有分析RTN 4B与生存预后的关系;未分析RTN 4B与胃癌细胞增殖、侵袭、凋亡等生物学行为的关系。未来需要开展临床及基础研究,进一步探讨RTN 4B在胃癌发生发展中的作用机制。