桑黄裂蹄针层孔菌提取物生物活性成分及功能特性分析

闫帅帅，郭辛茹，徐建国，晋程妮

（山西师范大学食品科学学院，山西 太原 030000）

随着我国人口老龄化的加剧以及人民生活水平的日益提高，慢性疾病已成为影响国民经济和社会发展的重大公共卫生问题之一。研究表明，药食用真菌富含维生素、微量元素、三萜、酚类和多糖等营养或功能成分[1]，对常见的慢性疾病（糖尿病、炎症、消化系统疾病、恶性肿瘤和心血管等疾病）具有积极的治疗作用[2]。因此，在慢性疾病高发和饮食营养摄取不均衡的环境下，药食用菌化学和生理功能研究受到产学界的广泛关注。

桑黄裂蹄针层孔菌（Phellinuslinteus）隶属多孔菌目锈革孔菌科针层孔菌属的一种药用真菌。主要生长于阔叶树的树干及枯立木上，其子实体多年生，呈扁半球形至马蹄形或不规则形，黑色至深黑色，有明显龟裂，菌肉硬木质。桑黄裂蹄针层孔菌作为一种常用的木层孔菌，其多糖、蛋白聚糖、吡喃酮、多酚、甾醇等生物活性化合物在体内外具有潜在的药理学活性[3-4]，具有抗氧化、调节免疫、改善肠道、抗癌、抑制血糖等作用[5-6]。张嫱[7]研究发现木蹄层孔菌胞外多糖可以增加缺氧小鼠体内血细胞数量、显著降低高脂小鼠肝组织过氧化、减少伤口感染；其分子修饰后衍生物可以抑制人食管癌细胞的增殖、延长相关癌变细胞的生长周期。Liu 等[8]研究表明桑黄裂蹄针层孔菌提取物可以在糖尿病大鼠模型中降低血糖水平、增强胰岛素抵抗和糖原储存，促进肝脏中关键酶β-氧化酶的表达，减少糖尿病相关的肝和肾损伤。但绝大多数已发表的关于桑黄裂蹄针层孔菌的研究，多集中在多糖的提取、分离和纯化技术、结构特征、药理活性和潜在的机制探索等方面，对于其他活性成分的功效研究较少。因此，本研究测定桑黄裂蹄针层孔菌不同极性溶剂提取物的总酚、麦角甾醇含量，分析具有抗氧化作用的潜在多酚物质，比较抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性，并对其可能的机制进行讨论，以期为该菌资源开发及综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑黄裂蹄针层孔菌，采自吉林敦化市，经60 ℃干燥至恒重，将样品粉碎过筛（40 目），置于室温，密封保存，备用。

福林酚试剂、没食子酸、抗坏血酸、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚：山西博汇垣科贸有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2'-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline）-6-sulfonic acid，ABTS]、2，4，6-三吡啶基三嗪（2，4，6-three pyridyl three triazine，TPTZ）、麦角甾醇、原儿茶酸、表儿茶素、咖啡酸、槲皮素、肉桂酸、山奈酚、水杨酸：上海源叶生物科技有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-alpha-d-glucoside，pNPG）、α-葡萄糖苷酶（20 U/mg）、阿卡波糖、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：美国Sigma 公司；除特殊标记外，其他均为分析纯。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（UltiMateTM3000）、酶标仪（Thermo Multiskan FC）：美国Thermo Fisher 公司；旋转蒸发仪（Model R-3）：瑞士BUCHI Labortechnik 公司；低速台式离心机（TDL-60C 型）：上海安亭科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 桑黄裂蹄针层孔菌提取物制备

准确称取10 g 桑黄裂蹄针层孔菌粉末6 份，分别置于6 个锥形瓶中，按1∶10（g/mL）料液比分别加入蒸馏水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚提取溶剂，于30 ℃、100 W 超声功率下提取2 h，5 000 r/min 离心10 min 后，收集上清液；残渣采用同样的方法再重复提取、离心2 次，合并3 次上清液，将获得的不同溶剂提取物进行浓缩定容至25 mL，得到的不同溶剂提取物样液放于4 ℃冰箱储存。

1.3.2 总酚含量的测定

根据Aboagye 等[9]的方法并稍作修改。取0.1 mL不同溶剂提取的样品溶液，加入0.1 mL 福林酚试剂和2.8 mL 蒸馏水，摇匀，室温避光静置8 min，再加入2 mL 7.5%的Na2CO3溶液，摇匀，室温避光静置1 h，于765 nm 波长处测定吸光度。用没食子酸测定标准曲线的回归方程：y=0.001 6x-0.144 1（R2=0.994）。总酚含量表示为每克桑黄裂蹄针层孔菌干样中没食子酸当量的毫克数（mg GAE/g DW）。

1.3.3 多酚成分高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析

通过高效液相色谱仪对桑黄裂蹄针层孔菌不同溶剂提取物中多酚成分进行分析，检测条件如表1所示。

表1 HPLC 分析多酚成分检测条件Table 1 Determination conditions of polyphenol components by HPLC

1.3.4 HPLC 法测定麦角甾醇的含量

根据杜娇[10]的方法并稍作修改。色谱柱：岛津Inertsil C18 柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）。用0.22 μm 滤膜过滤不同溶剂提取物溶液。0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）为流动相进行梯度洗脱：0～10 min，30%～80%B；10～30 min，80%～100%B。流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，波长为283 nm，进样量20 μL，麦角甾醇保留时间约为17.1 min。

1.3.5 抗氧化活性测定

1.3.5.1 DPPH 自由基清除能力

根据Yu 等[11]的方法并稍作修改。将不同溶剂提取物稀释成不同的浓度梯度，各取0.5 mL 加入到2 mL的DPPH 溶液中，摇匀，室温下避光反应30 min，于517 nm 波长处测定其吸光度，每组重复3 次。DPPH 自由基清除率（Y1，%）计算公式如下。

式中：A0为对照组吸光度；A1为样品吸光度；A2为样品颜色空白吸光度。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力

参照Yan 等[12]的方法并稍作修改。将不同溶剂提取物稀释成不同浓度梯度的溶液，各取0.1 mL 加入到3.8 mL 的ABTS 溶液中，摇匀，室温下避光6 min，于734 nm 波长处测定吸光度。ABTS+自由基清除率（Y2，%）计算公式如下。

式中：A0为对照组吸光度；A1为样品吸光度；A2为样品颜色空白吸光度。

1.3.5.3 铁还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）的测定

参照Alkan 等[13]方法并稍作修改。不同溶剂提取物各取0.1 mL，加入3.1 mL 蒸馏水和1.8 mL 的TPTZ 工作液，37 ℃反应30 min，于593 nm 波长处测定混合样品溶液吸光度。使用10～100 μmol/L 浓度的FeSO4·7H2O测定标准曲线，回归方程：y=2.317x+0.142（R2=0.999 4）。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶活性抑制的测定

参照Yan 等[14]的方法并稍作修改。在96 孔板中加入80 μL 不同浓度的提取物样品溶液和20 μL 0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液，并在37 ℃温育5 min。随后，加入100 μL 的4 mmol/L pNPG 溶液，37 ℃下反应30 min，最后加入100 μL 的4 mmol/L Na2CO3终止反应。用酶标仪检测在405 nm 处释放出的对硝基苯酚量。α-葡萄糖苷酶活性的抑制率（Y3，%）计算公式如下。

式中：A0为对照组吸光度；A1为对照组空白吸光度；A2为样品吸光度；A3为样品颜色空白吸光度。

1.4 数据分析

所有试验结果重复3 次，用平均值±标准差表示；使用SPSS 20 进行显著性分析（p＜0.05）；使用Origin 8.6进行数据处理、作图分析。

2 结果与分析

2.1 多酚含量

采用福林酚法对桑黄裂蹄针层孔菌子实体不同溶剂提取物的多酚含量进行测定，结果见图1。

图1 桑黄裂蹄针层孔菌不同溶剂提取物多酚含量的测定Fig.1 Polyphenol content of different solvent extracts of Phellinus linteus

由图1 可知，乙醇提取物的多酚含量（3.03±0.27）mg GAE/g DW 显著高于其他提取溶剂（p＜0.05）；不同溶剂提取物多酚含量由高到低的顺序为乙醇＞丙酮＞水＞乙酸乙酯＞氯仿＞石油醚。同时，桑黄裂蹄针层孔菌多酚含量随有机提取溶剂极性增大而提高，有机提取溶剂极性越大，多酚含量越高，与徐蔓[15]的研究结果相一致，这可能与植物大多数功能成分为复杂的有机物以及相似相溶原理相关。

2.2 多酚成分分析

7 种多酚标准品的色谱图见图2。

图2 7 种多酚标准品的色谱图Fig.2 Chromatograms of seven standard substances

由图2 可知，通过HPLC 分析，掌握7 种多酚类物质（原儿茶酸、表儿茶素、咖啡酸、槲皮素、肉桂酸、山奈酚、水杨酸）对应的保留时间、响应值以及峰面积，以便于进一步对桑黄裂蹄针层孔菌多酚成分进行分析。

6 种不同溶剂桑黄裂蹄针层孔菌提取物多酚成分定量分析见表2。

表2 桑黄裂蹄针层孔菌不同溶剂提取物多酚成分分析Table 2 Analysis of polyphenol components in different solvent extracts of Phellinus linteus

由表2 可知，6 种提取溶剂均有较高的表儿茶素、槲皮素和山奈酚含量，肉桂酸含量最少。原儿茶酸、表儿茶素、槲皮素和肉桂酸在水提取物中含量最高，分别为（29.02±0.11）、（202.34±1.08）、（143.99±0.31）、（0.77±0.01）μg/g；咖啡酸和山奈酚在乙醇提取物中含量最高，分别为（5.06±0.02）μg/g 和（111.68±0.65）μg/g。相较于郑娜[16]的研究结果，本研究不仅高于5 种桑黄子实体的60%乙醇提取物中咖啡酸的含量，也高于低共熔溶剂对裂蹄针层孔菌菌丝体和子实体提取物中咖啡酸的含量；但肉桂酸的含量相对较低，这可能与裂蹄针层孔菌子实体的年份、储藏环境等相关。

2.3 麦角甾醇含量

麦角甾醇作为药食用真菌中最具代表性的甾醇类小分子物质，具有显著的生理活性功能，采用HPLC对桑黄裂蹄针层孔菌子实体不同溶剂提取物的麦角甾醇含量进行测定，结果见图3。

图3 桑黄裂蹄针层孔菌不同溶剂提取物麦角甾醇含量的测定Fig.3 Ergosterol content of different solvent extracts of Phellinus linteus

由图3 可知，不同溶剂提取物的麦角甾醇含量由高到低的顺序为乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞氯仿＞水＞石油醚。其中乙醇提取物中麦角甾醇含量最高，且丙酮、乙酸乙酯提取物中麦角甾醇含量与乙醇提取物中麦角甾醇含量差异不显著（p＞0.05），与李洁莉等[17]研究结果相近，醇提取物麦角甾醇含量显著高于水提取物。王晓琴等[18]对12 种真菌及其产品的麦角甾醇含量进行了分析，其中紫芝子实体、桦褐、茯苓麦角甾醇的含量在0.17～0.46 mg/g；段雨晴等[19]对23 批桦褐孔菌中麦角甾醇进行定量分析，平均含量为0.31 mg/g，均低于裂蹄针层孔菌乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物的麦角甾醇含量。

2.4 抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性

桑黄裂蹄针层孔菌子实体不同溶剂提取物对DPPH 自由基、ABTS+自由基清除能力和铁还原能力、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定结果见表3。

表3 桑黄裂蹄针层孔菌提取物的抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 3 Antioxidant activity and α-glucosidase inhibitory activity from different extracts of Phellinus linteus

由表3 可知，水具有最强的DPPH 自由基清除能力，乙醇、丙酮的DPPH 自由基清除能力与水的DPPH自由基清除能力相当，且显著高于其他溶剂提取物及抗坏血酸，其IC50值分别为（20.92±0.79）、（23.37±0.83）、（21.87±0.55）μg/mL；不同溶剂提取物对DPPH 自由基清除能力由高到低的顺序为水＞丙酮＞乙醇＞乙酸乙酯＞氯仿，石油醚没有DPPH 自由基清除能力。乙醇提取物有最强的ABTS+自由基清除能力，IC50为（78.42±1.28）μg/mL，且强于抗坏血酸；不同溶剂提取物对ABTS+自由基清除能力由高到低的顺序为乙醇＞丙酮＞水＞乙酸乙酯＞氯仿，石油醚没有ABTS+自由基清除能力，且桑黄裂蹄针层孔菌不同溶剂提取物对ABTS+自由基清除能力均弱于DPPH 自由基清除能力。乙醇提取物有最高的铁还原能力，FRAP 值为（50.05±1.90）mmol/g，除氯仿和石油醚提取物外，均显著高于抗坏血酸；不同溶剂提取物铁还原能力由高到低的顺序为乙醇＞丙酮＞水＞乙酸乙酯＞氯仿＞石油醚。并且DPPH 自由基、ABTS+自由基清除能力和铁还原能力与有机提取溶剂的极性呈正相关。

已有较多关于层孔属真菌的提取物的抗氧化能力研究。曹春蕾等[20]研究发现3 种木层孔菌子实体乙酸乙酯提取物对DPPH 自由基清除能力均大于氯仿提取物。杨建等[21]研究发现5 种野生多孔菌的乙醇提取物均比乙酸乙酯提取物有更强的DPPH 和ABTS+自由基清除能力，且ABTS+自由基清除能力均弱于DPPH，这与本文结果一致；同时本文桑黄裂蹄针层孔菌乙醇提取物在DPPH 和ABTS+自由基清除方面，有更小的IC50值，因此有更强的抗氧化能力。红缘拟层孔菌不同浓度乙醇溶液提取物[22]、桑黄低共熔溶剂提取物[23]、火木层孔菌和裂蹄针层孔菌的水提物及醇提物[24]的DPPH 和ABTS+自由基清除能力，均弱于本研究不同溶剂桑黄裂蹄针层孔菌提取物的抗氧化能力。

由表3 可知，不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力由高到低依次为丙酮＞乙醇＞乙酸乙酯＞水＞氯仿，石油醚没有α-葡萄糖苷酶活性抑制能力，可以看出，α-葡萄糖苷酶活性抑制能力与有机提取溶剂的极性呈正相关，且均强于阿卡波糖。本研究乙醇和丙酮的桑黄裂蹄针层孔菌提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制的IC50分别为（13.95±0.79）μg/mL 和（9.87±0.33）μg/mL，高于前人研究中桑黄子实体的氯仿、乙酸乙酯、水提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力（IC50分别为0.12、0.07、0.07 mg/mL）[25]。与本文结果相似的是，Feng 等[26]研究表明裂蹄针层孔菌提取物通过改变肝脏磷脂代谢和调控胰岛素信号转导改善胰岛素抵抗，从而实现对高脂饮食小鼠的血糖控制；Oh 等[27]揭示裂蹄针层孔菌提取物是通过潜在的40 个化合物和48 个基因实现对2 型糖尿病的改善。因此，裂蹄针层孔菌不仅能够抑制α-葡萄糖苷酶活性，还能实现对胰岛素的有效调控，对改善血糖具有潜在的应用价值。

2.5 相关性分析

通过热图对不同溶剂提取物多酚、麦角甾醇含量与抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性进行相关性分析。热图见图4。

图4 不同溶剂提取物多酚和麦角甾醇含量与抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性的相关性分析Fig.4 Correlation between polyphenol and ergosterol contents in different solvent extracts and antioxidant and α-glucosidase inhibitory activity

由图4 可知，桑黄裂蹄针层孔菌不同溶剂提取物的多酚含量与ABTS+自由基清除能力、FRAP 和α-葡萄糖苷酶抑制活性间呈显著相关，相关系数分别为-0.822、0.995 和-0.920；DPPH 自由基清除能力与ABTS+自由基清除能力呈极显著相关，相关系数为0.951，因此桑黄裂蹄针层孔菌具有显著的抗氧化活性可能与其多酚类物质有关。此外，酚酸作为酚类物质最丰富的活性成分之一，可能具有潜在的抗氧化活性，在6 种提取溶剂中表儿茶素含量较为丰富，与DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力之间的相关系数分别为-0.740 和-0.715，且与咖啡酸具有极显著相关性，而咖啡酸与原儿茶酸具有极显著相关性，原儿茶酸与槲皮素、肉桂酸之间呈显著相关性，可能是这些酚酸类物质协同作用[28]，使得不同溶剂桑黄裂蹄针层孔菌中多酚与抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性有关。

3 结论

以桑黄裂蹄针层孔菌为研究对象，采用6 种不同溶剂对其有效成分进行提取，结果表明乙醇提取物有最高的多酚和麦角甾醇含量，这可能与萃取体系的极性相关。植物多酚作为天然的抗氧化剂，通过清除机体内部有害自由基从而达到预防疾病的效果。具有最高多酚含量的乙醇提取物表现出显著的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性作用；相关性结果表明，不同溶剂桑黄裂蹄针层孔菌提取物多酚含量与Fe3+还原能力有极显著相关性、与ABTS+自由基清除率和α-葡萄糖苷酶抑制活性有显著相关性；综上，桑黄裂蹄针层孔菌多酚类物质具有潜在的生物活性功能。

相关性分析进一步表明，表儿茶素与咖啡酸具有极显著相关性，原儿茶酸与咖啡酸、槲皮素具有极显著相关性，而多酚显示出抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，因此不同溶剂提取物的功能活性可能与多种活性成分协同作用相关。本研究为全面了解桑黄裂蹄针层孔菌的活性成分和功效提供了有力的依据，对丰富和开发其药用产品具有重要意义。然而，对抗氧化和α-葡萄糖苷酶活性抑制起作用的具体物质，还需进一步研究。