气相色谱法测定三七粉及含三七原粉类中成药中17种有机氯类农药残留

2023-12-07谢秋红邵大志马晓静宋瑩崔业波马彧

化学分析计量 2023年11期

谢秋红，邵大志，马晓静，宋瑩，崔业波，马彧

（1.四平市中心医院，吉林四平 136000； 2.四平市食品药品检验所，吉林四平 136000）

三七为五加科三七的干燥根及根茎，具有散瘀止血，消肿定痛功效。三七粉在临床使用由来已久，尤其在我国北方地区深受患有心血管疾病老人的欢迎，而三七原粉入成药的品种，《中华人民共和国药典》2020 年版一部收载的大约有70 多个品种，在部颁标准中收载的大约有30多个品种，含三七药粉的药品临床疗效确切，利用价值高。近年来三七市场需求量巨大，每年约3.5 万吨[1-6]。中药材种植者施用农药防治病虫害是提高中药材产量的有效措施，但同时也影响了中药材的品质，增大了用药风险。

《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版一部中收载的三七质量标准中，没有有机氯类农药残留量检查项。而GB 2763—2021《食品中农药最大残留限量标准》、《药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》、《无公害三七药材及饮片的农药残留与重金属及有害元素残留限量》、《中华人民共和国药典》(2020 年版)“药材和饮片检定通则”对33种禁用农药的残留限量做出规定，WM/T2-2004 则规定了有机氯农药的残留限量[7]。T/CATCM 003—2017 团体标准参考《中国药典》及美国、欧盟、日本和韩国等国家及地区相关标准，对三七中206 种农药制定了限量标准，是我国记载三七农药残留限量最全的标准，但普及度和法律效应不及GB 2763—2021和《中国药典》。

三七药材中有机氯类等农药残留情况报道和研究较多[8-13]，且五氯硝基苯超标的情况时有报道，现阶段对中成药中有机氯类农药的测定方法报道较少[16-17]，在食品、水果和蔬菜中研究报道较多[18-21]，检测方法多为气相色谱法。《中华人民共和国药典》四部通则2341第一法也为气相色谱法，该法存在氧化氯丹与δ-六六六、顺式环氧七氯与反式环氧七氯、p，p'-滴滴滴与p，p'-滴滴涕等组分的分离效果不佳和样品处理繁琐等缺点。笔者在此基础上，采用DM-1701 毛细管柱，优化色谱条件，使17 种有机氯类农药组分均达到基线分离。该方法具有样品处理简单、分析速度快、灵敏度高、专属性好的特点。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱仪：7890B 型，配63Ni-ECD 电子捕获检测器，美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：BP211D型，感量为0.1 mg，北京赛多利斯仪器天平有限公司。旋转蒸发仪：EⅤ311型，莱伯泰科有限公司。

高速离心机：TG16-WS 型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

二氯甲烷、丙酮和正己烷：色谱纯，成都市科隆化学品有限公司。

硫酸、无水硫酸钠和氯化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

有机氯农药混合对照品溶液：含有六氯苯、α-六六六、五氯硝基苯、γ-六六六、七氯、艾氏剂、β-六六六、氧化氯丹、δ-六六六、顺式环氧七氯、反式环氧七氯、反式氯丹、顺式氯丹、p，p'-滴滴伊、o，p'-滴滴涕、p，p'-滴滴滴、p，p'-滴滴涕17 种有机氯农药，质量浓度依次为10.03、9.71、9.90、9.62、9.84、9.77、8.89、9.79、7.55、9.73、9.65、9.46、9.32、9.86、9.92、9.32、9.28 μg/mL，批号为610005-202003，中国食品药品检定研究院。

五氯硝基苯对照品溶液：1 000 mg/mL，批号为A1907264，坛墨质检标准物质中心。

三七粉及含有三七成分中成药样品：共23 批，其中三七粉3 批、中成药6 种20 批，包括三七伤药片、丹七片、腰息痛胶囊等，市售，具体信息见表1。

表1 样品信息

1.2 仪器工作条件

分析柱：DM-1701型毛细管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm，北京迪马克科技有限公司)；载气：氮气；流量：1.5 mL/min；进样口温度：230 ℃；进样方式：不分流进样；色谱柱温度：程序升温，初始温度为60 ℃，保持0.5 min，以10 ℃/min 的速率升至240 ℃，保持3 min，再以20 ℃/min 的速率升至280 ℃，保持5 min；63Ni-ECD电子捕获检测器温度：300 ℃。

验证柱：DB-5 型毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司)；载气：氮气；初始流量：1.5 mL/min，恒压模式；色谱柱温度：程序升温，初始温度60 ℃，保持0.3 min，以60 ℃/min 的速率升至170 ℃，再以10 ℃/min 的速率升至220 ℃，保持10 min，再以1 ℃/min的速率升至240 ℃，再以15 ℃/min 的速率甚至280 ℃，保持5 min；其它条件同分析柱。

1.3 溶液配制

有机氯农药混合对照品储备液：0.1 μg/mL。准确移称取有机氯农药混合对照品溶液1 mL，置于100 mL 的容量瓶中，用正己烷定容至标线，混匀，0～4 ℃冰箱中密封保存。

有机氯农药系列混合标准工作溶液：依次移取有机氯农药混合对照品储备液适量，用正己烷稀释配制质量浓度分别为5、10、20、50、100 ng/mL 的有机氯类农药系列混合标准工作溶液，现用现配。

五氯硝基苯标准溶液：0.1 mg/mL。准确移取五氯硝基苯对照品溶液1 mL，置于100 mL 的容量瓶中，用正己烷定容至标线，混匀，再移取1 mL，置于100 mL的容量瓶中，用正己烷定容至标线，混匀，于0～4 ℃冰箱中密封保存。

1.4 样品处理

按日服用量，称取三七粉或含有三七成分中成药样品，置于具塞锥形瓶中，加入水30 mL，振摇使完全崩解(或溶散)，准确加入丙酮50 mL，称定质量，超声30 min，放冷，再称定质量，用丙酮补足减失的质量。加入氯化钠约8 g，准确加入二氯甲烷25 mL，称定质量，超声15 min，再称定质量，用二氯甲烷补足减失的质量，振摇使氯化钠充分溶解，静置，转移至离心管中，以3 000 r/min 离心3 min，将有机相转移至装有适量无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，放置30 min。准确移取15 mL，于40 ℃减压浓缩至约1 mL，加入正已烷约5 mL，减压浓缩至近干，用正己烷溶解并转移至5 mL容量瓶中，用正己烷定容至标线，摇匀，移至离心管中，缓缓加入硫酸溶液(硫酸与水体积比为9∶1)1 mL，振摇1 min，以3 000 r/min 离心10 min，分取上清液，加水1 mL，振摇，取上清液，作为样品溶液。同法制备空白溶液。

1.5 实验方法

取样品溶液和有机氯农药系列混合标准工作溶液各1 μL，注入气相色谱仪中，按照1.2项下分析柱色谱条件分析，得各农药残留对照品线性方程；样品溶液中如检出与相应农药残留对照品保留时间相一致的色谱峰，则取对应浓度的有机氯农药对照品溶液，连续同法分析3次，取3次平均值，按外标法计算其含量，并用验证柱对检出成分进行验证。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

《中国药典》2020 年版四部通则2341 第一法9种有机氯农药残留测定法[14]，以(14%-氰丙基-苯基)甲基聚硅氧烷或(5%苯基)甲基聚硅氧烷为固定液，依法操作，p，p'-滴滴滴与p，p'-滴滴涕无法充分分离。22 种有机氯农药残留测定法，以50%苯基-50%二甲基聚硅氧烷为固定液，依法操作，氧化氯丹与δ-六六六和顺式环氧七氯与反式环氧七氯等多组分均无法充分分离。因此，选择固定液为键合交联14%氰丙基苯基二基硅氧烷的色谱柱进行试验。

分别对同规格30 m×0.32 mm，0.5 μm的色谱柱OⅤ1701 柱、DM1701 柱和DB1701 柱进行筛选，17种有机氯类农药对照品在上述三款色谱柱上的分离效果有明显差异。DM-1701柱分离效果最好，色谱图见图1，空白溶液在16.8 min 时有一色谱峰，与7号色谱峰保留时间17.1 min不一致；而DB1701柱采用恒压模式，初始流量为1.5 mL/min，程序升温同验证柱条件，可较好地分离17个农药对照品。试验结果表明，OⅤ1701柱较难获得较好的色谱图，通过调整程序升温条件、氮气流量及分析模式，β-六六六、氧化氯丹、δ-六六六和顺式环氧七氯的分离效果仍不理想。考虑到样品中可能有杂质对结果有干扰，需要用DB-5 柱进一步验证，笔者对19 批检测出五氯硝基苯的样品采用DB-5柱对分析柱的检测结果进行验证，验证结果均可得到与五氯硝基苯对照品保留时间相一致的色谱峰，证明检测结果无误。综合上述，最后选取DM-1701色谱柱。

图1 DM1701分析柱气相色谱图

2.2 柱温

《中国药典》2020 年版四部通则2341 第一法分别针对9种和22种有机氯类农药残留分析，均采用程序升温，但依法操作，均难以得到理想的分离效果图。参考人参药材质量标准[15]，优化程序升温条件，将原来5个阶段程序升温优化至三个阶段。初始温度保持时间延长至0.5 min，增加各组分的保留值；第二阶段柱温提高至240 ℃，保持3 min，升温速率为10 ℃/min，确保氧化氯丹与δ-六六六和顺式环氧七氯与反式环氧七氯达到基线分离；第三阶段柱温280 ℃，保持5 min，升温速率提高至20 ℃/min，确保o，p'-滴滴涕检出的同时，缩短分析时长。

2.3 样品处理

《中国药典》2020 年版四部通则2341 第一法22种有机氯类农药残留分析方法，样品通过乙腈提取后需要经凝胶渗透色谱柱净化，然后再经过弗罗里硅土固相萃取柱净化，操作繁琐，且准确度不高。取样品日服用量，参考9 种有机氯类农药残留分析方法和人参质量标准，用硫酸对溶液进行净化，置换试剂改为正己烷，消除溶剂干扰的同时，并缩短样品处理时间，提高方法的准确性。

2.4 线性关系和检出限

取有机氯农药系列混合标准工作溶液，按照1.2分析柱色谱条件，分别进样分析，记录色谱图，以各农药质量浓度为横坐标，以对应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性方程及相关系数。

取农药残留对照品溶液10 ng/mL，用正己烷适当稀释，按照信噪比法计算各农药残留对照品检出限，以信噪比约为3∶1 时对应的质量浓度作为对应组分的检出限。

17 种有机氯农药线性关系及方法检出限列于表2。由表2数据可知，各组分线性相关系数均不小于0.998，表明在对应浓度范围内线性关系良好。

表2 17种有机氯农药线性关系及方法检出限

2.5 样品加标回收试验

取上述23 批次样品，用该方法测定，有19 批样品检出五氯硝基苯，其它农药组分均未检出。19批阳性样品中，丹七片等5批样品超出限度，存在一定的安全隐患。因此，按照丹七片处方工艺，取丹参250 g 按照处方工艺提取浓缩，不添加三七粉，加入等量的淀粉与糊精混匀，制备阴性样品。

取上述阴性样品3.5 g，精密称定，共计6 份，置于具塞三角瓶中，准确量取2 mL有机氯农药混合对照品储备液(0.1 μg/mL)，待低温挥干溶剂后，按照1.4方法处理，得加标样品溶液，照1.2分析柱色谱条件分析，以色谱峰面积外标法定量，计算回收率及相对标准偏差，结果列于表3。由表3可知，17种有机氯类农药平均回收率为90.3%～102.2%，相对标准偏差为1.8%～2.8%，表明该方法准确度、精密度均良好。