基层常用口蹄免疫抗体检测试剂在应用中的对比分析

杜玉玲，张 颖，卢世豪，葛 东，祖长清，赵达卓*

1.延边朝鲜族自治州动物疫病预防控制中心，吉林延吉 133000；2.珲春市动物疫病预防控制中心，吉林珲春 133300；3.敦化市官地镇综合服务中心，吉林敦化 133700

口蹄疫（FAM）是一种由口蹄疫病毒引起的急性、热性、高度接触性传染病。主要影响偶蹄类动物，如牛、羊、猪等。口蹄疫会导致患病动物的生产性能下降，不仅对养殖业造成重大威胁，还会严重影响畜牧业发展。

口蹄疫作为一种严重危害牲畜健康的疫病，一旦发生将给农业生产带来巨大的经济损失。为了有效应对口蹄疫的流行和控制，口蹄免疫抗体检测成为一种非常重要的手段。尤其是在2017 年吉林省全面建成免疫无口蹄疫区，各地区易感动物的免疫质量是保证免疫无口蹄疫区正常运行的关键，也是免疫无口蹄疫区的一个重要指标，而免疫质量的评价主要依赖于实验室免疫抗体检测评价，由口蹄疫参考实验室生产的液相阻断免疫吸附试验诊断试剂盒成为实验室检测口蹄疫免疫抗体的主要方法和试剂，同时该诊断方法为了减少实验时间，在传统方法上进行了改良，为了检验两种试剂盒在实际检测工作中的效果和差别，指导现地充分利用好人力和物力资源，做好免疫无口蹄疫区工作，通过春秋两季对延边州8 个县（市）采取分层抽样策略，各层中分别进行简单随机抽样概率，对免疫过口蹄疫O型、A 型二价疫苗21 d 后的共计320 份牛血清，进行O 型、A 型免疫抗体检测，在成本、准确性和操作难易度等方面对比分析传统型和改进型检测盒的性能，致力于为兽医工作者提供准确、可靠、更加适用于基层的免疫抗体检测盒，以进一步提高口蹄疫的防控效果。

1 材料与方法

1.1 免疫疫苗

强制免疫口蹄疫二价灭活苗。

1.2 血清样品

延边州8 个县（市）320 头免疫过牛口蹄疫O 型、A 型二价灭活疫苗21 d 以上的牛血清。

1.3 检测试剂盒

口蹄疫O 型、A 型抗体液相阻断ELISA 检测（改进型）试剂盒（FAM-O-ELISA 改进型、FAM-A--ELISA 改进型），口蹄疫O 型、A 型抗体液相阻断ELISA 检测（传统型）试剂盒（FAM-O-ELISA 传统型、FAM-A-ELISA 传统型）。

1.4 检测步骤

对于采集的320 份牛血液样本在4 ℃条件下，2 000 转/min，离心5 min 后取上清液，按检测盒使用说明操作（见表1）。

表1 检测步骤与时间

1.5 结果判定

根据试剂盒的判断标准实验结果符合成立条件后，计算临界值，即OD 值450 nm 计算病毒抗原阻断1/2 的值。被检样品的检测OD 值大于临界值，该样本抗体为阴性；被检样品检测OD 值小于等于临界值，该样本抗体为阳性。梯度稀释被检样本中，阳性孔的最高稀释倍数即为该被检样本的抗体效价。牛的抗体效价≥1:128，99%以上保护。

2 结果

2.1 检测步骤与时间

由表1 可见，FAM -液相阻断- ELISA 传统型检测盒操作步骤有六步，需要移板一次，需要包被过夜，洗板三次，仅固定等待时间（操作时间不计）耗时225 min。FAM -液相阻断- ELISA 改进型检测盒操作步骤为四步，直接在反应板上稀释，不需要移板，不需要过夜，洗板两次，固定时间75 min。相比较之下，FAM -液相阻断- ELISA 传统型检测盒操作步骤多，繁琐，耗时长，FAM -液相阻断-ELISA 改进型检测盒操作步骤相对简单、方便，所需检测时间更短，仅为FAM -液相阻断- ELISA 传统型检测盒操作时间的1/3 左右。

2.2 检测抗体合格率

使用FAM -液相阻断- ELISA 传统型检测盒检测O 型、A 型口蹄疫抗体合格率分别为84.3%、80%；使用FAM -液相阻断- ELISA 改进型检测盒检测O型、A型口蹄疫抗体合格率分别为76%、74.3%（见表2）。传统型检测盒抗体阳性率高于改进型检测盒，敏感性更高。

表2 改进型和传统型检测盒检测抗体合格率统计表

2.3 改进型和传统型检测盒符合率

使用FAM-液相阻断- ELISA 传统型检测盒检测O 型、A 型的合格样本中各有6 份、18 份样本为FAM-液相阻断- ELISA 改进型检测盒的不合格样品，两者检测结果相差较大，符合率达90%和94.38%,见表3。

表3 改进型和传统型检测盒检测符合率

3 讨论

3.1 检测结果分析

两种检测试剂检测到的标准均能达到国家标准，但FAM -液相阻断- ELISA 改进型检测盒检测结果满足不了免疫无口蹄疫区保护率达到80%的要求，在免疫无疫区评定上存在明显差异。

从表1 可以看出FAM -液相阻断- ELISA 传统型检测盒检测O 型、A 型抗体阳性率均高于FAM -液相阻断- ELISA 改进型检测盒，说明口蹄疫液相阻断酶联免疫吸附试验检测试剂盒敏感性更高。

从表2 可以看出FAM -液相阻断- ELISA 传统型检测盒O 型、A 型抗体和FAM-液相阻断- ELISA改进检测盒符合率均在90%以上。

3.2 试剂性能讨论

FAM -液相阻断-ELISA 改进型实验比FAM -液相阻断 -ELISA 传统型实验的操作步骤少，实验用时少，更节省时间，两种口蹄疫抗体检测试剂盒各有优缺点。FAM -液相阻断- ELISA 传统型实验检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点，相对于改进型存在操作步骤繁琐，耗时长的缺点。而改进型检测试剂盒具有操作简便、用时短、成本低等优点，但也存在与传统型敏感性低的不足。为此在实际工作中，要根据试验需求等实际情况进行选择，避免因为检测试剂选择造成的工作失误和增加不必要物资与劳动力的浪费。

在两种试剂检测操作中，人员、仪器、耗材、环境均为统一，最大可能地减少了外界因素造成的误差，存在的弊端本次实验仅对牛的口蹄疫免疫效果进行了比较，没有全面覆盖易感动物。同时春秋两季延边地区牛的饲养方式有所不同，可能造成免疫牛只的机体免疫应答敏感性不同，但该项对实际检测结果的判定不存在干扰性。