单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡生长性能、抗氧化能力和肠道形态结构的影响

2023-12-04徐朋涛陈亚兵刘诚傲郭双双张正帆丁斌鹰

动物营养学报 2023年11期

徐朋涛陈亚兵陈靖何来刘诚傲郭双双张正帆** 丁斌鹰**

(1.武汉轻工大学,农副产品蛋白质饲料资源教育部工程研究中心,动物营养与饲料科学湖北省重点实验室,武汉 430023;2.天门市农业农村局,天门 431700)

坏死性肠炎是肉鸡养殖中常见的传染性消化道疾病,主要由A型和G型产气荚膜梭菌引起,通常与球虫病一起发生或由球虫病继发感染,造成肉鸡食欲减退、肠道出血和溃疡、腹泻率增加,生长性能下降,急性感染可导致鸡群大量死亡,造成巨大经济损失[1-3]。在我国饲料禁抗、养殖过程限抗和减抗的时代背景下,寻找天然、绿色的饲料添加剂防控家禽坏死性肠炎迫在眉睫。单宁酸(tannic acid,TA)是一类多酚类化合物,广泛存在于五倍子、栗木和高粱等植物中,具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗腹泻等多种功效[4]。研究表明,饲粮中添加水解单宁酸可通过改善营养物质消化吸收率提高饲料转化效率,改善肉鸡生长性能,还可以通过清除自由基降低氧化应激,提高肉鸡抗氧化能力,并能够防止肝脏代偿性增大[5-8]。但是单宁酸是否能通过促进肠道发育和提高抗氧化能力改善球虫和产气荚膜梭菌混合感染引起的坏死性肠炎尚不明确。因此,本研究旨在探讨单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡生长性能、器官指数、血清生化指标、血清和肝脏抗氧化指标以及肠道形态结构的影响,为单宁酸对肉鸡坏死性肠炎的防护提供一定数据参考和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

产气荚膜梭菌由中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC2030)提供。球虫四价活疫苗购自佛山市某生物技术有限公司。水解单宁酸(含量≥80%)由湖北省某生物科技有限公司提供。

1.2 试验设计

试验采用单因素完全随机设计,选取平均体重为(46.40±0.40) g的1日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡294只,随机分为3组,分别为对照组(CON组)、混合感染组(CCP组)和单宁酸+感染组(CTA组),每组7个重复,每个重复14只,公母各占1/2。CON组、CCP组饲喂基础饲粮,CTA组在基础饲粮中添加1 000 mg/kg水解单宁酸,试验期为28 d。基础饲粮参照《Arbor Acres Broiler Nutrition Specifications(2019)》并结合实际配制,其组成及营养水平见表1。其中,粗蛋白质(CP)、钙(Ca)含量分别参照GB/T 6432—2018、GB/T 6436—2018的方法测定;分别参照GB/T 6437—2018与苏琪等[9]的方法测定总磷(TP)和植酸磷(PP)含量,计算得出非植酸磷(NPP)含量;代谢能(ME)和可消化氨基酸含量根据《中国饲料成分及营养价值表(2021年第32版)》中数据计算得出。在第7天和第10天,CCP组和CTA组每只鸡按照球虫疫苗制造商推荐剂量的30倍灌服1 mL球虫悬液(灭菌生理盐水配制,含3×104个孢子囊/mL),CON组灌服1 mL灭菌生理盐水。试验第16～20天,CCP组和CTA组每只鸡每天灌服1 mL产气荚膜梭菌新鲜菌液(活菌数为1×108CFU/mL),CON组灌服1 mL灭菌疱肉培养基。肉鸡自由采食,充足饮水,按正常免疫程序进行免疫接种。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

1.3 样品采集

试验第14、21和28天从每个重复随机选取接近平均体重的2只鸡,用抗凝的真空采血管[抗凝剂:乙二胺四乙酸(EDTA)和肝素钠]翅下静脉采血5 mL,采血后颈动脉放血致死。将血液常温送至实验室,4 ℃条件下3 500 r/min离心10 min,取上清分装于干净的EP管中,置于-80 ℃冰箱冷冻储存;使用剪刀和镊子打开腹腔进行屠宰取样,解剖分离出肝脏、脾脏、十二指肠、空肠、回肠、胸腺和法氏囊,将肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊剔除脂肪后进行称重;再取十二指肠、空肠、回肠中段1 cm的肠段置于4%的多聚甲醛液中进行固定,然后将样品送至武汉博士德生物工程有限公司进行组织石蜡包埋,制成苏木精-伊红(HE)染色切片;将剩余的十二指肠、空肠、回肠和肝脏样品剪碎,用灭菌锡箔纸包好,标记后放入液氮速冻,之后取出保存于实验室-80 ℃冰箱备用。

1.4 检测指标和方法

1.4.1 生长性能

试验期间每日以重复为单位记录采食量和死亡情况,分别于14、21和28日龄以重复为单位称取空腹状态下肉鸡体重,计算各重复的平均体重(ABW)、平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。计算公式如下:

ABW=每阶段肉鸡总末重/鸡数;
ADFI=总采食量/试验天数;
ADG=总增重/试验天数;
F/G=ADFI/ADG。

1.4.2 器官指数

分别于14、21和28日龄屠宰肉鸡,分离肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊,剔除周边组织和脂肪,用滤纸擦干血水进行称重,并计算器官指数,计算公式为:

器官指数(%)=[器官重量(g)/

鸡体重(g)]×100。

1.4.3 血清生化指标

使用日立7100全自动生化分析仪检测血清中总蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、葡萄糖(glucose,GLU)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、钙、磷、尿酸(uric acid,UA)含量以及γ-谷氨酰转移酶(γ-glutamyl transferase,GGT)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性。

1.4.4 血清和肝脏抗氧化指标

采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒使用多功能酶标仪(Spectra Max M5,Molecular Devices,美国)测定血清和肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(hydrogen peroxidase,CAT)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性和总抗氧化力(total antioxidant capacity,T-AOC)以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)和过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)含量。

1.4.5 肠道形态结构

使用OLYMPSBX-41TF型光学显微镜对肠道组织切片进行观察,应用HPISA-1000高清彩色病理图文报告系统分析。每张肠道组织切片选取8～10个不同走向且相对完整的绒毛,测量该绒毛高度(VH)及其隐窝深度(CD),取平均值作为最终测量值,并计算绒毛高度/隐窝深度(V/C)。

1.5 数据统计与分析

所有数据均使用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析,当组间差异显著时,采用Duncan氏多重比较法进行组间差异显著性分析。试验结果以平均值±标准差表示,P<0.05表示差异显著,0.05≤P<0.10表示差异有显著的趋势。

2 结果与分析

2.1 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡生长性能的影响

由表2可知,与CON组相比,球虫和产气荚膜梭菌混合感染显著降低了肉鸡14、21和28日龄的ABW以及1～14日龄、15～21日龄和1～28日龄的ADG和ADFI(P<0.05),显著提高了1～14日龄、15～21日龄和1～28日龄的F/G(P<0.05)。与CCP组相比,饲粮中添加1 000 mg/kg单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染造成的肉鸡各阶段生长性能下降无显著改善作用(P>0.05)。

2.2 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡器官指数的影响

由表3可知,14日龄时,与CON组相比,CCP组肉鸡肝脏指数显著提高(P<0.05),胸腺指数和法氏囊指数显著降低(P<0.05);CTA组肉鸡各器官指数与CCP组差异不显著(P>0.05)。21日龄时,CCP组肉鸡胸腺指数显著高于CON组和CTA组(P<0.05)。28日龄时,CCP组和CTA组肉鸡脾脏指数显著高于CON组(P<0.05);与CON组和CCP组相比,CTA组肉鸡肝脏指数显著提高(P<0.05)。

表3 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡器官指数的影响 Table 3 Effects of tannic acid on organ indices of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens %

2.3 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡血清生化指标的影响

由表4可知,与CON组相比,CCP组肉鸡14日龄血清ALB、TC和HDL含量显著降低(P<0.05),21日龄血清GLU、HDL和Ca含量以及28日龄血清HDL含量显著降低(P<0.05),21日龄血清GGT和LDH活性与28日龄血清磷(P)含量显著升高(P<0.05)。CTA组对肉鸡各日龄血清生化指标与CCP组相比均无显著差异(P>0.05)。

表4 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡血清生化指标的影响Table 4 Effects of tannic acid on serum biochemical indices of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens

2.4 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡血清和肝脏抗氧化指标的影响

由表5可知,CCP组肉鸡14日龄血清GSH-Px、CAT和T-SOD活性显著低于CON组和CTA组(P<0.05)。与CON组相比,CCP组肉鸡21日龄血清GSH-Px和CAT活性显著降低(P<0.05);与CCP组相比,CTA组肉鸡21日龄血清GSH-Px、CAT和T-SOD活性显著升高(P<0.05)。CCP组肉鸡28日龄血清CAT活性显著低于CON组和CTA组(P<0.05)。CCP组肉鸡14和28日龄血清H2O2含量显著高于CON组和CTA组(P<0.05)。

表5 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡血清抗氧化指标的影响Table 5 Effects of tannic acid on serum antioxidant indices of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens

由表6可知,CCP组肉鸡14日龄肝脏CAT活性显著低于CON组和CTA组(P<0.05),同时肝脏MDA含量显著高于CON组和CTA组(P<0.05)。CCP肉鸡组21日龄肝脏CAT和T-SOD活性显著低于CON组和CTA组(P<0.05)。CCP组肉鸡28日龄肝脏T-SOD活性显著低于CON组和CTA组(P<0.05)。CCP组肉鸡各日龄肝脏H2O2含量均显著高于CON组和CTA组(P<0.05)。

表6 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡肝脏抗氧化指标的影响Table 6 Effects of tannic acid on liver antioxidant indices of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens

2.5 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡肠道形态结构的影响

由表7可知,CTA组肉鸡14日龄十二指肠VH和V/C显著高于CON组和CCP组(P<0.05),同时十二指肠和空肠CD显著低于CON组和CCP组(P<0.05)。与CON组,CCP组肉鸡21和28日龄十二指肠、空肠、回肠VH和V/C显著降低(P<0.05),同时十二指肠和空肠CD显著增加(P<0.05);与CCP组相比,CTA组肉鸡肠道形态结构得到改善。

表7 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡肠道形态结构的影响Table 7 Effects of tannic acid on intestinal morphology of broilers co-infected with coccidia and Clostridium perfringens

3 讨论

3.1 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡生长性能的影响

球虫感染可导致肉鸡肠道黏膜损伤,破坏肠道稳态,易继发感染产气荚膜梭菌[2,10-11]。产气荚膜梭菌可产生多种毒素,最终引起鸡坏死性肠炎,导致营养物质消化利用率下降,饲料转化率和体重降低[12-13]。本研究结果表明,混合感染球虫和产气荚膜梭菌后,肉鸡生长性能下降,说明肠道损伤模型构建成功[14-15]。研究表明,饲粮中添加10～300 mg/kg原花青素、葡萄籽提取物和五倍子单宁酸能显著改善肉鸡的生长性能[16-18]。但也有研究表明1 000 ～2 000 mg/kg单宁酸会显著降低肉鸡的日增重和饲料转化效率[19-20]。本研究发现,1 000 mg/kg单宁酸不能改善球虫和产气荚膜梭菌混合感染引起的肉鸡生长性能下降,这与Choi等[21]和Xu等[22]的报道结果不一致。这些结果表明单宁酸的生物学效价可能呈剂量依赖效应,和单宁酸种类、提取工艺和饲粮结构密切相关。

3.2 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡器官指数的影响

胸腺、脾脏和法氏囊是家禽的主要免疫器官,肝脏是机体脂肪代谢的重要场所。研究表明,球虫感染和坏死性肠炎会导致肉鸡肠黏膜损伤,引起肉鸡肠道功能紊乱,使肠道细菌及其代谢产物易位进入肝脏[23-24]。Daneshmand等[25]研究发现,产气荚膜梭菌会刺激脾细胞导致T细胞繁殖发育。本试验表明,球虫感染后肉鸡肝脏指数提高,法氏囊指数和胸腺指数降低,可能导致肉鸡免疫力下降。本结果与童玉鑫等[7]的研究结果一致。而产气荚膜梭菌感染显著提高了肉鸡胸腺指数和脾脏指数,这与张元可[26]和陈锁[27]的研究结果不一致。其原因可能是产气荚膜梭菌刺激了胸腺和脾脏淋巴细胞繁殖发育,引起了肉鸡的代偿性调节。

3.3 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡血清生化指标的影响

血清TC、TG、LDL和HDL含量可以反映机体脂质代谢情况,过高或过低均会引起血脂异常,导致疾病发生[28]。本试验中,混合感染球虫和产气荚膜梭菌显著降低了肉鸡血清TC和HDL含量,表明球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡后可能导致脂质代谢紊乱。LDH与细胞能量代谢和ATP的产生有关,细胞受损会使LDH释放到细胞外,降低能量利用率[29]。本研究结果表明,球虫和产气荚膜梭菌混合感染引起肉鸡肠道炎症,可能导致肠上皮细胞和免疫细胞损伤,从而导致LDH释放增加。血清GGT活性能一定程度反映肝脏健康状况,肝脏受损导致肝细胞细胞膜通透性增加,GGT活性升高[30-31]。本试验结果表明,球虫和产气荚膜梭菌混合感染可能引起肉鸡肝功能紊乱,影响肝脏代谢和物质转运,从而导致生长性能下降。此外,球虫和产气荚膜梭菌混合感染降低了肉鸡血清GLU和Ca含量,导致机体糖代谢紊乱,可能是肝脏功能、肾脏功能紊乱和坏死性肠炎引起的[32]。

3.4 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡抗氧化能力的影响

动物体内抗氧化酶活性和MDA含量可反映机体抗氧化能力强弱。已有研究证明,球虫和产气荚膜梭菌混合感染可增加肉鸡体内活性氧的产生,引起机体氧化应激[22]。Li等[33]和Zhao等[34]报道,球虫和产荚膜梭菌感染肉鸡血清和肝脏中CAT、SOD和GSH-Px等酶活性降低。与前人报道一致,本试验结果表明,球虫和产荚膜梭菌混合感染显著降低了肉鸡血清和肝脏GSH、CAT和T-SOD活性,提高了血清和肝脏MDA和H2O2含量。Zhang等[35]研究表明,250和500 mg/kg五倍子单宁酸改善了黄曲霉毒素B1感染肉鸡的抗氧化能力。Xi等[5]研究发现,250 mg/kg单宁酸可以降低黄曲霉毒素B1感染肉鸡血清MDA含量,提高血清CAT和GSH-Px活性。结合以上研究结果可知,饲粮中添加1 000 mg/kg单宁酸可以改善球虫和产气荚膜梭菌混合感染引起的肉鸡抗氧化能力下降。

3.5 单宁酸对球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡肠道形态结构的影响

研究表明,球虫和产气荚膜梭菌混合感染会造成肉鸡小肠形态结构损伤,引起营养物质的消化吸收率下降[22,35-37]。李军辉等[6]报道,饲粮中添加水解单宁酸显著提高了肉鸡十二指肠和空肠VH和V/C,降低了CD。Yang等[17]研究发现,饲粮中添加17 mg/kg葡萄原花青素显著改善了肉仔鸡空肠形态结构。与前人报道一致,本研究发现球虫和产气荚膜梭菌混合感染造成肉鸡小肠形态结构受损,并且饲粮中添加1 000 mg/kg单宁酸能明显改善球虫和产气荚膜梭菌混合感染肉鸡小肠形态结构。