结节性硬化症一家系新发TSC2基因变异分析

刘林莉,于春水

结节性硬化症 (tuberous sclerosis complex, TSC) 是一种常染色体显性遗传综合征,其发病率为1/6 000～1/10 000[1]。致病基因为TSC1和TSC2基因,分别编码错构瘤蛋白和马铃薯球蛋白,两种蛋白可于体内形成功能复合物,调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路,从而在细胞生长、增殖中发挥关键作用[2]。TSC临床特征表现为多器官多系统受累,如皮肤、中枢神经系统、肾脏、心脏、肺、眼等,中枢神经系统肿瘤是TSC患者最主要的死亡原因[3]。TSC患者临床表型差异较大,且发病年龄、全身受累程度及严重程度各不相同,其临床特征在一生中动态呈现,但几乎所有的TSC患者都有皮肤受累[3],皮肤科医生早期识别皮损并进行早期诊断,对于患者后续的监测和管理至关重要。本研究收集以皮损为主要表现的一个结节性硬化症家系的临床资料,并对该家系的先证者及患者进行基因变异检测。

1 材料与方法

1.1临床资料 患者男,16岁,面部起红色丘疹逐渐长大10余年。患者10余年前无明显诱因面部出现红色细小丘疹,质地柔软,表面光滑,无疼痛及瘙痒不适,以鼻部为中心,对称分布,皮损逐渐增多,疹色较前变红,严重影响美观。患者既往有癫痫病史,曾口服药物治疗(具体不详),自诉近年未发作。体检:面中部多发红色、褐色的圆顶状丘疹,对称分布,鼻部及面颊部为重,质地柔软;前额可见棕色斑块,质地柔韧(图1a),颈部可见多发色素减退性雪花样斑(图1b),后腰部可见斑块,似皮革样外观,质地柔韧(图1c)。毛发、指甲及牙齿均未见异常。患者生长发育良好,听力及视力正常,智力水平正常,其他器官系统未见明显异常。先证者父母非近亲结婚,其母亲与先证者有相似的病史及临床表现,表现为面颊部对称分布的肤色细小丘疹(图1d)及全身多处色素减退斑(图1e～1g)。其余家族成员未见类似症状。

家族史:家族3代5人中共有患者2例,男1例,女1例,分别为先证者及其母亲(图2)。均于出生后不久出现色素减退斑,学龄期出现面部红色丘疹,先证者合并癫痫病史,皮损更为广泛,临床表型较其母亲更为严重。其余家系成员均正常,无隔代遗传现象,符合常染色体显性遗传。

根据患者的病史、临床表现及家族史,根据TSC临床诊断标准[1],诊断为TSC。

1.2方法

1.2.1二代测序 经遂宁市中心医院伦理委员会许可(伦理批文编号:LLSNCH20200042),患者家属签署知情同意书,采集先证者及其父母、外祖父、外祖母的外周静脉血各2 mL,置于含有乙二胺四乙酸试剂管中抗凝。采用血液基因组DNA提取试剂盒(目录号:DP348)提取DNA。构建DNA文库,并进行DNA文库质检。使用的探针由遗传性皮肤病权威专家设计,涵盖超过500个与遗传性皮肤病密切相关的基因(由罗氏NimbleGen合成),测序平台选用 Illumina Hiseq X Ten,平均测序深度可达200以上,Q30>90%,将测序结果比对到人类参考基因组(GRCh37/hg19),参考dbSNP、OMIM、HGMD等多种数据库对致病变异位点进行评估,并使用SIFT、Polyphen2、MutationTaster等多种蛋白功能预测软件进行基因变异导致蛋白功能预测。结合先证者的临床表型并根据 ACMG 遗传变异分类标准与指南进行变异筛选。

1.2.2Sanger测序验证 按照试剂盒说明书提取血液基因组DNA。对先证者及其父母的TSC2基因第39和40号外显子进行PCR扩增。扩增引物TSC2-E39-40-F:5′-CGAGATCAGCCTTCAGCACA-3′,TSC2-E39-40-R:5′-CGGCTATGATGCACCTGTGAG-3′。PCR反应条件:94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循环30次。再对所得的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,再切胶回收予以产物纯化,纯化产物用测序仪(ABI 3730)直接测序。测序结果采用Chromas2.0软件与TSC2基因参考序列对比。

1.2.3变异致病性分析 在HGMD、1000 Genomes、ExAC等数据库查询目标变异位点的收录情况,在PubMed数据库检索变异研究情况,根据2015年ACMG遗传变异分类标准与指南对变异进行分级和致病性判读[4]。

2 结果

2.1二代测序筛查结果 二代测序发现患者存在TSC2:NM_000548:exon40:c.5108dupT杂合变异,引起氨基酸序列发生移码(p.Ser1704Valfs*2),成为候选致病突变。

2.2Sanger测序验证 患者TSC2基因第40号外显子存在c.5108dupT(p.Ser1704Valfs*2)杂合变异(图3a),其5 108位碱基处存在T碱基重复(c.5108dupT),导致第1 704位丝氨酸Ser变成缬氨酸Val,其后的氨基酸序列发生移码,并在其后的第2位氨基酸处出现终止密码子(p.Ser1704Valfs*2),先证者母亲存在相同基因变异(图3b)。其他家庭成员及100个无关正常对照均未检测到该位点变异(图3c)。

Proband;Proband′s mother;Control

2.3变异致病性分析 根据ACMG遗传变异分类标准与指南进行致病性分析显示:TSC2基因c.5108dupT(p.Ser1704Valfs*2)为移码变异,可引起开放阅读框发生改变,导致蛋白功能改变,为极强致病性证据(PVS1);该变异在HGMD、ExAC、1000G等数据库中未见收录,是报道过的新变异,为中等致病性证据(PM2);该变异与疾病在家系中共分离,为支持证据(PP1);先证者的表型及家族史高度符合单基因遗传病结节性硬化症,为支持证据(PP4)。根据ACMG遗传变异分类标准与指南,TSC2基因c.5108dupT(p.Ser1704Valfs*2)变异为致病变异(PSV1+PM2+PP1+PP4)。

3 讨论

结节性硬化症是由TSC1或TSC2基因致病性变异所致。TSC1或TSC2基因变异可导致mTORC1通路异常激活,通过调节下游的S6K和4E-BP等去促进蛋白质的合成,可导致TSC相关性错构瘤,如血管平滑肌脂肪瘤、面部血管纤维瘤等;同时异常激活的mTORC1可引起黑色素生成过程中的自噬紊乱,导致TSC特征性的色素减退斑[5]。TSC具有高度的遗传异质性,全身多器官多系统参与TSC的发生,不同患者临床表型和疾病严重程度各不相同,男性TSC患者的临床表型往往较女性患者更重[6],而TSC2基因变异导致的临床表型也往往较TSC1变异所致的更重,更易导致患者智力障碍[7]、癫痫的发病年龄更早以及更大的肾血管平滑肌脂肪瘤等[8]。在不同基因变异类型的研究中发现,无论是TSC1 还是TSC2 基因变异,其中错义致病变异可能导致更高的脑损伤风险[9]。

本研究中,患者临床表现为面部血管纤维瘤、前额纤维斑块、鲨革鱼样斑、色素减退斑,伴有癫痫病史,根据最新的TSC临床诊断标准[1],可临床确诊为TSC,其母亲也有类似皮肤表现。经过基因检测发现,先证者TSC2基因40号外显子存在c.5108dupT(p.Ser1704Valfs*2)杂合变异,先证者母亲也存在相同基因变异,先证者其他家庭成员及100名无关正常对照未检测出该位点变异,且国内外文献亦未有关于此变异的报道,该变异是TSC2基因的一个新的致病变异。TSC2基因由42个外显子组成,编码由长约200 kDa的由1 807个氨基酸组成的马铃薯球蛋白,TSC2基因C端的1 525～1 770位氨基酸为其GTP 酶激活蛋白(GAP)结构域[10],c.5108dupT(p.Ser1704Valfs*2)变异位于该GAP结构域中,导致第1 704位丝氨酸变成缬氨酸,并在其后的第2位氨基酸处出现终止密码子,对马铃薯球蛋白结构完整性产生影响,可使mTORC1通路异常激活,调节下游S6K、4E-BP等磷酸化,促进蛋白质的合成和翻译,从而导致TSC的临床表型出现。

TSC的临床表型可能随着时间的推移和年龄的不同而变化,因此,目前最新的结节性硬化症诊断指南建议,只要鉴定出TSC1或TSC2基因中的致病变异就足以诊断TSC[1],TSC1和TSC2基因变异致病性定义为TSC1或TSC2 蛋白功能失活(即插入、缺失或无义变异)、阻止蛋白质合成(即基因组缺失变异),或者是通过蛋白功能试验评估的致病性错义变异,应遵循美国医学遗传学学会 (ACMG) 解释序列变异的标准和指南[4]。但未能识别的TSC1或TSC2基因中的致病变异并不能排除TSC的诊断,因常规基因检测无法识别内含子剪切位点变异以及体细胞镶嵌等[11]。所以临床医生早期识别 TSC的表现,予以基因检测并早期诊断,对于患者的健康监测和随访至关重要。

TSC患者的皮损往往是最早发生的最容易被识别的临床指标,构成 TSC 诊断标准的一部分的皮肤病学表现包括色素改变(色素减退斑、“五彩纸屑样”白斑)和皮肤错构瘤(血管纤维瘤、头部纤维斑块、甲纤维瘤和鲨革鱼样斑)。一项最新的研究发现,部分TSC患者的胸腰椎、背部、骶部的皮肤发现了粟粒纤维瘤,认为这也是TSC的一种良性皮损[12]。色素减退斑通常出现在出生时或婴儿期出现,可能是TSC的首发体征,早发的3 个或更多直径≥5 mm 的色素减退性斑,需警惕TSC可能[13],临床上需要与白癜风、无色素痣、贫血痣、白色糠疹等相鉴别;面部血管纤维瘤见于大约75% 的 TSC 患者,通常出现在儿童早期约2～5 岁之间出现,面部血管纤维瘤也可见于BHD综合征、MEN1和Cowden综合征等,但幼儿多发性面部血管纤维瘤的出现几乎是 TSC 的特异性表现,基因检测可予以鉴别[14]。对于TSC皮损的治疗主要包括手术切除、激光治疗及药物治疗(雷帕霉素抑制剂)。对于一些有症状的(如出血、刺激、疼痛、毁容或功能受损等)较大的病变,可以考虑手术切除治疗[15]。最影响患者美观的面部血管纤维瘤,可以联合饵激光、染料激光和CO2激光等治疗,也可以考虑PDL或者联合ALA光动力等治疗[16]。外用0.2%西罗莫司凝胶对TSC患者面部血管纤维瘤、头部纤维斑块和色素减退斑持续有效且耐受良好[17]。

综上,本研究发现一个TSC家系致病基因TSC2的新变异,该变异的发现及鉴定扩大了TSC2基因的突变谱,丰富了遗传及临床数据库,为TSC基因型和临床表型的研究提供了价值信息,也为未来的产前诊断打下了基础。