基于网络药理学对参芪地黄汤治疗糖尿病视网膜病变的主要活性成分及潜在基因分析

林称心，李光智

海南省中医院内分泌科，海南海口 570203

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是糖尿病的主要并发症之一，可导致患者视力下降，甚至失明，是糖尿病患者致残的主要原因之一[1]。在中医学理论里DR 属于“消渴目病”范畴，是因素体阴虚，虚火旺盛，耗气伤津致使目睛失养所引发的疾病[2]。所以治疗上应当扶正固本、益气养阴。参芪地黄汤就是基于这一治法开发而来。参芪地黄汤的前期临床随机对照研究表明，DR 患者规律服用该方12 周，能显著降低眼底检查评分[3]。然而，由于参芪地黄汤治疗DR 的作用机制尚未明确，这也限制了该方的进一步推广。为初步探讨参芪地黄汤治疗DR 的机制，给进一步的实验室研究做好前期铺垫。本研究采用网络药理学方法，分析出了参芪地黄汤治疗DR 的药物-化合物-靶基因机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 参芪地黄汤主要活性成分和药物作用靶基因的筛选

本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP）(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索参芪地黄汤组成药物：太子参、黄芪、熟地黄、山药、枸杞子、山萸肉、泽泻、丹皮、茯苓、决明子、甘草的所有活性成分。活性成分筛选条件设置为口服利用度≥30% 和类药性≥0.18[4]。此外，本研究还通过TCMSP 检索出活性成分的靶基因。

1.2 DR 疾病基因的获取以及交集基因的筛选

本研究通过基因卡数据库（https://www.genecards.org/）中输入关键词：Diabetic Retinopathy，检索DR 的疾病基因并建立数据集。然后将疾病基因与1.1 筛选出的药物靶基因取交集，得到两者的交集基因，并利用文氏图展示。

1.3 交集基因中的核心基因筛选

STRING 数据库(http://string-db.org)能够通过人类已知的蛋白相互作用信息，预测出所检索蛋白中的核心蛋白[5]。基于这一点，本研究通过STRING数据库建立交集基因的蛋白互作网络（proteinprotein interaction network, PPI）（参数设置为：a.物种限制为人类；b.隐藏游离点；c.设定置信度＞0.7；d.其他保持默认设置），对交集基因进行分析，获取蛋白相互作用，并保存其TSV 格式文件，最后将TSV格式文件导入Cytoscape3.9.0 软件绘制PPI 网络，用于后续进一步分析。

1.4 中药名-活性成分-交集基因网络的建立

为了筛选参芪地黄汤治疗DR 的关键活性成分，本研究将1.1 和1.2 部分得到的中药、中药活性成分和交集基因导入Cytoscape3.6.1 软件建立药物-活性成分-交集基因的相互作用网络关系图，并利用该软件中的CytoNCA 插件分析网络节点的相关拓扑参数。

1.5 交集基因的细胞功能注释分析与通路富集分析

为获取交集基因的细胞功能注释和信号通路富集分析结果，本研究最后再将1.2 获取的交集基因导入DAVID 在线工具（https://david.ncifcrf.gov/）进行分析。

2 结果

2.1 参芪地黄汤有效成分及药物靶点的筛选结果

在TCMSP 数据库本研究共检索到179 种参芪地黄汤主要活性成分，并获得这些活性成分作用的靶基因320 个。

2.2 疾病基因和交集基因的筛选结果

通过Gene cards 数据库本研究收集到DR 的疾病基因3 834 个，与2.1 的药物基因进行交集分析后得到交集基因143 个。

2.3 核心基因的筛选结果

本研究将2.2 中获得的交集基因导入STRING数据库，建立PPI 互作网络。随后将获得的数据录入Cytoscape 进行网络分析，得到143 个节点，2 873条边。使用Cytoscape NCA 插件计算Betweenness unDir、Closeness unDir、Degree unDir 值，值越高说明该节点在PPI 网络中越核心[4]。其中前5 个核心基因为丝氨酸/苏氨酸激酶1（protein kinase B, AKT1）、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-alpha, TNFα)、白细胞介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)。

2.4 中药-活性成分-交集基因网络

本研究利用Cytoscape 3.9.0 软件，构建了一个包含中药名-活性成分-交集基因的关系网络。通过对该网络的拓扑分析，发现度值最高的前五个活性成分分别是槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和异鼠李素。

2.5 细胞功能注释及通路富集分析结果

在DAVID 平台，本研究根据错误发现率（false discovery rate, FDR）＜0.01 分别对143 个交集基因的细胞功能和通路富集情况进行了分析。结果显示：细胞功能共有976 种，其中涉及生物过程的有767种；涉及细胞组成的有81 条；涉及分子功能的有128 条。通路富集分析方面，本研究还找到了101条信号通路，根据FDR 由小到大排名前十的有癌症通路、糖尿病并发症中的高级糖基化终末产物-受体信号通路、脂质与动脉粥样硬化、流体剪切力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、胰腺癌、癌症中的蛋白聚糖、前列腺癌、内分泌耐药、膀胱癌。根据FDR＜0.01 分别列出了前10 条GO 条目和KEGG 通路，见表1、表2。

表1 潜在基因的细胞功能注释结果（FDR＜0.01）

表2 通路富集分析结果（FDR＜0.01）

3 讨论

在本研究中，通过Cytoscape 3.9.0 软件筛选出的参芪地黄汤治疗DR 度值最高的前5 个活性成分为槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇、异鼠李素。其中，槲皮素被发现可以对DR 模型小鼠的炎症反应产生抑制作用，而且该研究还指出，这种作用是通过抑制TNF-α、IL-6 和IL-1β 产生的，这与本研究的研究结论基本一致，从侧面证实了本次研究的可靠性[6]。山奈酚有研究证实靶向调控VEGF，抑制AKT1/外来信号调节激酶1/2 信号通路的激活从而对DR 产生治疗作用[7]。异鼠李素也有研究发现可以通过抑制线粒体蛋白激酶/核因子-κB 信号通路，减轻DR 大鼠视网膜损伤及细胞凋亡[8]。而豆甾醇和β-谷甾醇对于DR 的干预作用，目前暂无相关研究报道，可以作为下一步的研究方向。

通过PPI 网络图，本研究筛选出参芪地黄汤治疗DR 的前5 个核心基因为AKT1、TNF-α、IL-1β、IL-6、VEGF。

AKT1 属于蛋白激酶B 家族，是磷脂酰肌醇3-激酶下游信号通路的主要效应器之一，对调节糖脂代谢具有重要作用，根据其不同功能，AKT 还可细分为AKT1、AKT2 和AKT3 三个亚型。在这些亚型中，AKT1 在人体各类组织器官中表达广泛[9]。

AKT1 通过与同源结构域的信号蛋白和磷脂酰肌醇依赖激酶Ⅰ结合，并与磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸结合，从而转移到细胞膜上，调节细胞的糖原合成、糖异生和葡萄糖摄取[10]。这些功能使得AKT在细胞内维持糖平衡方面扮演着关键的调节者角色。所以AKT 对人体糖代谢有着重要影响，参芪地黄汤可能通过对该基因的调控，稳定糖代谢，从而对DR 产生治疗效果[11]。

最近的研究表明，炎症反应在DR 病程中扮演着重要角色，许多炎症因子例如：TNF-α、IL-1β、IL-6 和VEGF 等都对DR 的发展起着促进作用[12]。

TNF-α 是机体炎症反应的先导因子，一旦TNF-α 与其特异性受体结合，便能够通过促进其他炎症因子的释放，从而介导炎症反应过程[13]。TNF-α 广泛分布于视网膜组织中的血管内皮细胞，激活后会提高视网膜血管通透性，并加速血管内皮细胞增殖及血管外基质形成[14]。一份临床队列研究显示，DR 患者的泪液中TNF-α 水平显著超过健康人水平，并且TNF-α 水平与视网膜病变程度正相关[15]。

IL-1β 和IL-6 同属于趋化因子家族。过度释放的IL-1β 和IL-6 可能是视网膜疾病发展的一个重要潜在因素。据目前的报道，两者可能通过以下几种生物学机制对DR 产生影响：①促进炎症反应，不少研究显示IL-1β 和IL-6 会促进其他炎症因子的表达以及炎性细胞的募集，从而加重视网膜组织的炎性损伤[16]；②提高视网膜通透性，导致视网膜水肿。IL-1β 和IL-6 可以作用于多种细胞信号通路，从而降低紧密连接蛋白的表达以及减少血管紧张素水平，打破血管收缩平衡，从而造成视网膜血管内皮细胞损伤，最终导致视网膜通透性增加[17]。

VEGF 是一种具有高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，对DR 的影响主要体现在两个方面：①能增加血管通透性，导致视网膜水肿[18]；②提高视网膜局部细胞间粘附分子和其它活性物质的释放，导致血管内皮细胞增殖，促进视网膜新生血管生成[18]。

综上所述，本研究通过网络药理学研究，对参芪地黄汤治疗DR 的作用机制进行了初步的研究，研究发现了槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇、异鼠李素等活性成分以及AKT1、TNF-α、IL-1β、IL-6和VEGF 等药物作用基因。这些活性成分和基因均有相关文献报道与DR 紧密相关，从侧面证明了本次研究结果的可靠性。