HPLC法同时测定少林正骨精中5种成分的含量 及近红外定量模型的建立

王秋玲

(1.漳州片仔癀药业股份有限公司,福建 漳州 363000;2.福建省片仔癀天然医药研发 企业重点实验室,福建 漳州 363000)

少林正骨精收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第六册,执行标准为WS3-B-1108-92,是由仙桃草、当归、五加皮、独活、羌活、醋三棱、醋莪术、土鳖虫、艾叶、醋延胡索、花椒、血竭、乳香、伸筋草等20味药物组成的中药酊剂,具有活血祛瘀、消肿止痛、祛风散寒的功效,用于跌打损伤、积瘀肿痛、腰肢麻木、风湿骨痛。目前针对该产品的质量控制方法较少,部颁标准对冰片鉴别项和乙醇含量做了规定,王健[1]对血竭素、华春红[2]对蛇床子素的含量测定进行了研究,国家药典委员会最新公示的拟修订标准新增当归、羌活、独活、血竭对照药材鉴别项和樟脑、薄荷脑、冰片的含量测定项,暂未对该产品的药材成分进行含量测定研究。方中独活、羌活、当归具有活血止痛等功效,同时现代药理学表明其具有抗炎、镇痛等药效[3]。本实验拟对少林正骨精中独活、羌活、当归的主要活性成分含量进行考察。

独活的主要化学成分为香豆素类、挥发油类等,香豆素类的蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯是其主要活性成分[4];羌活的主要化学成分为香豆素类、挥发油类和烯炔类化合物,香豆素类的羌活醇、异欧前胡素为主要活性成分,且具有专属性[5];当归的主要化学成分为有机酸类、挥发油类等,其中阿魏酸最具代表性,为其主要活性成分[6,7]。本实验拟建立HPLC法同时测定少林正骨精中阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、异欧前胡素和二氢欧山芹醇当归酸酯的含量,为少林正骨精的质量控制提供参考依据。

中药具有复杂的成分,混合均匀度直接影响产品质量的一致性、安全性、有效性,在工艺稳定性评估过程中,应用色谱分析等方法时,操作繁琐、耗时较长,无法及时得到结果反馈,因此本研究引入近红外光谱法建立快速定量分析模型。近红外谱区主要记录C-H、O-H、N-H等基团,这些基团是有机物的重要组成元素,用于中药检测能得到丰富的信息,近红外光谱技术具有分析速度快、分析效率高、样品无需预处理等优点,结合化学计量学充分提取光谱中的有效信息建立定量模型[8],可应用于中药生产过程的质量评估[9,10]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(安捷伦公司,美国,型号:1260系列 DAD检测器),电子天平(梅特勒托利多科技(中国)有限公司,型号:XPR205/A),数显恒温水浴锅(常州市江南实验仪器厂),数控超声波清洗器KQ-500DE(昆山市超声仪器有限公司),MILLIPORE超纯水机(默克公司,德国,Direct-Q5 UV Kit),布鲁克MAP型傅里叶变换近红外光谱仪(布鲁克公司,德国,OPUS6.5光谱工作站)。

1.2 试药

阿魏酸(批号:110773-201915,纯度99.4%),羌活醇(批号:111820-202106,纯度97.5%),蛇床子素(批号:110822-202111,纯度99.7%),异欧前胡素(批号:110827-202113,纯度99.2%),二氢欧山芹醇当归酸酯(批号:111583-202006,纯度98.9%),均购于中国食品药品检定研究院;少林正骨精(漳州片仔癀药业股份有限公司,国药准字Z35020235)。乙腈为色谱纯(Merck),甲醇、二氯甲烷、磷酸为分析纯(西陇科学股份有限公司),水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 HPLC法测定5个成分的含量

2.1.1 色谱条件 色谱柱采用中谱红PX-C18(4.6mm×250mm,5μm);以乙腈为流动相A,0.1%磷酸水溶液为流动相B,梯度洗脱,色谱条件,见表1。流速1.0mL/min,检测波长320nm,柱温30℃,进样体积为5μL。

表1 色谱条件

2.1.2 对照品混合溶液制备 精密称取对照品阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯适量,分别置于25mL棕色量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,制成阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯的单一对照品母液。

分别精密量取上述对照品母液2mL、2mL、5mL、2mL、2mL于同一个25mL棕色量瓶中,用甲醇定容至刻度,混匀,即得,浓度分别为阿魏酸36.48μg/mL、羌活醇37.32μg/mL、蛇床子素98.50μg/mL、异欧前胡素35.68μg/mL、二氢欧山芹醇当归酸酯36.36μg/mL。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密量取少林正骨精样品10mL,用二氯甲烷萃取3次,每次20mL,合并二氯甲烷液,蒸干,残渣加甲醇使溶解,分次转移至5mL棕色量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,用0.45μm滤头过滤,即得。阴性样品溶液的制备:取按处方比例制备同时缺独活、羌活、当归药材的阴性样品,按供试品溶液制备方法处理,即得。

2.1.4 专属性试验 分别吸取对照品混合溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各5μL,在“2.1.1”项色谱条件下进样分析。记录相应的色谱,见图1。阴性样品在与对照混合溶液相应的保留时间处,羌活醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯未有峰干扰,阿魏酸处有小峰,根据后面的实验结果表明对含量测定无影响,5个主成分峰的分离度符合要求。

2.1.5 线性关系及定量限考察 精密称取阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品适量于同一个50mL棕色量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,得到母液。分别精密量取1mL母液于100mL、50mL、25mL、10mL、5mL棕色量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,得到系列标准溶液,浓度分别为阿魏酸2.22μg/mL、4.44μg/mL、8.88μg/mL、22.21μg/mL、44.41μg/mL、222.06μg/mL,羌活醇2.32μg/mL、4.63μg/mL、9.27μg/mL、23.17μg/mL、46.33μg/mL、231.66μg/mL,蛇床子素5.92μg/mL、11.84μg/mL、23.68μg/mL、59.20μg/mL、118.40μg/mL、592.02μg/mL,异欧前胡素2.17μg/mL、4.35μg/mL、8.70μg/mL、21.74μg/mL、43.49μg/mL、217.45μg/mL,二氢欧山芹醇当归酸酯2.73μg/mL、5.46μg/mL、10.93μg/mL、27.32μg/mL、54.63μg/mL、273.16μg/mL,注入液相色谱仪,测定。以质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归,回归方程、相关系数r值、线性范围,见表2。表明各成分在一定的质量浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系。以信噪比10∶1(S/n=10)作为定量限,测得定量限分别为阿魏酸1.11ng、羌活醇5.79ng、蛇床子素2.96ng、异欧前胡素5.44ng、二氢欧山芹醇当归酸酯6.83ng。

2.1.6 精密度试验 取“2.1.2”项下混合对照品溶液,于“2.1.1”项色谱条件下连续进样6次,阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积的RSD分别为1.43%、1.86%、1.40%、1.14%、2.00%,表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 取按“2.1.3”项供试品溶液制备好的同一份供试品溶液,分别在0h、6h、12h、18h、24h、36h、48h时,于“2.1.1”项色谱条件下测定,阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯峰面积的RSD分别为1.42%、1.33%、1.69%、1.68%、1.87%,结果表明供试品溶液在48h内稳定。

2.1.8 重复性试验 取同一份样品溶液,按“2.1.3”项供试品溶液制备,平行提取6份供试品溶液,按“2.1.1”项色谱条件测定,测得阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯含量平均值分别为15.26μg/mL、12.07μg/mL、42.96μg/mL、9.74μg/mL、7.38μg/mL,RSD分别为1.54%、1.44%、1.84%、1.80%、1.98%,结果表明本方法重复性良好。

2.1.9 加样回收试验 取已知含量的同一批次样品(样品:9#)9份,每份精密吸取5mL,3份为一组,按供试品中待测成分与对照品加入量之比为1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例,加入适量对照品混合溶液,按“2.1.3”项下方法操作,制成供试品溶液,在“2.1.1”色谱条件下测定,计算回收率,结果表明本法具有较好的准确度,见表3。

2.1.10 样品的测定 取10个批次的少林正骨精,按“2.1.3”项下方法操作,于“2.1.1”项色谱条件下测定,计算阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯的含量,测定结果见表4。

表4 少林正骨精中5个成分的含量结果 (n=10)

2.2 近红外光谱模型建立及应用

2.2.1 光谱数据采集 吸取适量的样品溶液于扫描玻璃管中,置于样品台上,设置光谱采集参数:采集方式透射式Near-IR Transmittance(NIT),扫描波长为全波长(12 500～4 000cm-1),扫描次数为32Scans,分辨率为8cm-1,每份样品扫描3次,采集24个批次的样品溶液,近红外光谱见图2。

图2 少林正骨精近红外光谱

2.2.2 建立定量模型 样品中复杂的有机物质在近红外谱区多个波段都有信息,属于复杂光谱,通过OPUS6.5光谱工作站对光谱进行预处理,按照上述“2.1”项的含量测定方法对24个批次样品进行含量测定,得到5个主要成分的含量测定结果,选取其中21个批次作为参考集,剔除>2.5的吸收单位,选择波长12 500～7 100cm-1和6 500～5 300cm-1建模,运用偏最小二乘法(PLS)进行拟合建立阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯的定量分析模型,定量模型见图3。本研究运用矢量归一化(SNV)、一阶导数、一阶导数+MSC、一阶导数+SNV、多元散射校正、无光谱预处理等11种经典预处理方法进行优化,以均方根误差(RMSECV)为评价指标,优选出合适的预处理方法,并进行交叉验证,另取3个批次样品作为测试集,进行外部验证,得到预测值与化学测定值的RSD。优化后各个成分的较优的光谱预处理方法、RMSECV、波段范围、相关系数r值、预测均方根误差(RMSEP)、外部验证预测值与化学测定值的RSD范围见表5。

图3 阿魏酸、羌活醇、蛇床子素、异欧前胡

表5 近红外模型参数

2.2.3 模型的运用 本模型可用于少林正骨精灌装前配制液的快速检测。对少林正骨精灌装前的配制液进行多点取样,根据“2.2.1”光谱数据采集方法采集少林正骨精配制液的近红外光谱图,运用“2.2.2”建立的近红外定量分析模型对配制液的5个成分进行含量结果预测,得到各个配制液取样点的5个成分的含量结果,并计算不同取样点同一个成分含量结果的RSD值,根据“2.2.2”项下表5近红外模型参数中的RSD范围设定RSD值<13.10%时,该数值可以一定程度上反映配制液是否混合均匀,从而反映产品质量的稳定性。

3 讨论

3.1 含量测定

3.1.1 提取方法考察 分析少林正骨精的提取工艺,水提醇沉与醇提液混合,乙醇含量为51%～59%,乙醇水溶液极性较大溶解成分多,直接进样杂峰较多,影响分离效果,水溶性成分不易溶于中极性有机溶剂,香豆素类和有机酸均可溶于中极性有机试剂[11],试验分别考察了乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷提取率、提取次数、提取溶剂加入量对结果的影响,结果表明三氯甲烷和二氯甲烷,分3次提取,每次20mL可提取完全,考虑到三氯甲烷为易制毒试剂,最终选定二氯甲烷为提取溶剂,分3次提取,每次20mL。

3.1.2 检测波长及色谱条件的考察 通过DAD在190～400nm范围内对5个主成分峰和样品溶液进行光谱扫描,发现阿魏酸在322nm、羌活醇在310nm、蛇床子素在322nm、异欧前胡素在310nm、二氢欧山芹醇当归酸酯在326nm有最大吸收,根据样品中各个成分的吸收值大小,最终选定320 nm为检测波长。流动相分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%冰醋酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%冰醋酸水溶液体系,柱温分别考察了25℃、30℃、35℃,流速考察了0.8mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min。结合5个主峰的峰形、分离度和柱效,最终选定乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱,柱温30℃,流速1.0mL/min。色谱柱考察了中普红PX-C18(4.6mm×250mm,5μm)、Welch Ultimate XB-C18(4.6mm×250mm,5μm)、Thermo BDS Hypersil C18(4.6mm×250mm,5μm),在上述的色谱条件下三者均能达到较好的分离效果[12-15]。

3.1.3 专属性及回收率结果 由阴性样品色谱图可知,香豆素类成分具有良好的专属性,在阴性样品色谱图中阿魏酸的保留时间相对应的位置出现小峰,推测因为本方中艾叶含有微量的阿魏酸[16],但该色谱峰的信噪比仅为7.2低于定量限,结合阿魏酸的加样回收试验结果,可判断不影响本方法阿魏酸含量测定的专属性。

3.2 近红外定量分析模型

羌活醇、异欧前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯的真值与预测值RSD较大,一是因为近红外的吸收强度比中红外弱1～5个数量级,随着基频振动合频和倍频的增加,吸收峰重叠越严重,吸收越来越弱,近红外光谱技术适合含量>0.1%的常量分析[17];二是建模的批次较少,在后续的生产过程中会继续增加参考集的批次,进一步修正模型。该定量分析模型用于含量预测数据准确性稍显不足,可用于半定量判断少林正骨精配制液的均一性,用于少林正骨精生产过程中的在线监测。

本研究首次建立了一种高效液相色谱法同时测定少林正骨精中5种有效成分含量的方法,该方法简单有效,符合方法学验证,可用于少林正骨精质量控制;并应用近红外光谱技术建立了少林正骨精定量模型,作为生产过程在线监测体系中的一环,用于在产品灌装前判断配制液的均匀性,保证产品质量稳定。