心房颤动患者血清miR-29b和miR-135b水平表达与心房纤维化程度及射频消融术后复发的相关性研究

李晶晶，刘晓晨，刘恩香，王岳胜（沧州市人民医院心血管内科，河北沧州 061000）

心房颤动（atrial fibrillation，AF）简称房颤，是临床上常见的快速心律失常疾病[1]。AF是心功能不全、脑卒中等疾病的独立危险因素，易引起严重的并发症[2]。关于AF的发病机制目前尚未明确，有观点认为其可能与心房重构、心房纤维化等病理生理改变有关[3]。目前，治疗AF的主要方法有药物保守治疗、外科手术和射频消融术。其中射频消融术在治疗效果上较药物治疗、外科手术治疗要好，可以更好地维持患者的窦性心律，提高患者的运动耐力[4]。但射频消融术术后复发率较高，严重影响患者预后转归。因此，早期预测患者术后复发对于干预措施的制定具有一定临床意义。微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）是一种小的非编码单链RNA，21～23个核苷酸，在转录后调控基因表达水平[5]。miRNAs在细胞分化、胚胎发育及人类疾病的发病机制中发挥着重要作用[6]。有研究表明，miRNAs可能与心肌纤维化也有关[7]，miRNAs作用于心脏成纤维细胞并调控心脏成纤维细胞的存活[8]。miRNAs可在不同环节参与心房的结构重构，并参与AF的发生。近年来，关于miRNAs与AF关系的研究也越来越多[9]，但目前关于miRNAs的表达与射频消融术术后复发相关性的研究还处于初步阶段，因此，本研究检测AF患者血清miR-29b和miR-135b的表达，并分析miR-29b和miR-135b的表达与心房纤维化及AF患者射频消融术术后复发的相关性，旨在为AF患者术后复发预测相关生物标志物的寻找提供理论依据，期望改善AF患者预后。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019年7月～2022年7月于沧州市人民医院心血管内科住院诊治并接受射频消融术治疗的AF患者158例（病例组），其中男性82例，女性76例，平均年龄67.23±5.1岁，身体质量指数 (body mass index，BMI) 23.53±3.12 kg/m2。纳入标准：①患者符合人民卫生出版社第八版《内科学》指定的AF诊断标准[10]；②临床资料完整，基本资料匹配。排除标准：①瓣膜性房颤（机械瓣或生物瓣置换术后、二尖瓣修复后的房颤），心房血栓形成及病态窦房结综合征者；②既往接受过房颤消融术或起搏器植入术，环肺静脉隔离术后加行二尖瓣峡部、左房房顶、三尖瓣峡部、碎裂电位消融；③心电图质量较差影响测量，不能接受随访的患者。另选同期在本院体检的健康者126例（对照组），其中男性62例，女性64例，平均年龄68.29±4.85岁，BMI 23.46±3.10 kg/m2。两组一般资料比较差异无统计学意义（χ2/t=0.001,1.377,均P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会批准（审批号：20190522），两组受试者均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 日立7180全自动生化分析仪（江西仁隆生物技术），ABI 7500型qRT-PCR仪（美国ABI公司），RNA提取试剂（赛默飞世尔科技），逆转录试剂盒（德国Qiagen公司），SYBR Green Master Mix（2×）（北京伊塔生物科技有限公司），HD6彩色多普勒超声诊断系统（荷兰Philips公司）。

1.3 方法

1.3.1 一般资料收集：收集所有AF患者入院后的一般临床资料：包括性别、年龄、体重指数、吸烟史、糖尿病史、冠心病史等情况。

1.3.2 样本采集：采集所有患者术前清晨空腹肘静脉血5ml，低温静置30min，3 000r/min离心10min，留取上清，分装于无菌EP管中，于-20℃冰箱中保存，待测。

1.3.3 生化指标测定：射频消融术后，HD6彩色多普勒超声诊断系统收集患者的左心室射血分数（left ventricular fraction，LVEF）、左心房内径资料；采用全自动生化分析仪测定患者的空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、低密度脂蛋白-胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、谷氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferas，ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血肌酐（creatinine，CR）、尿酸（uric acid，UA）和血尿素（UREA）。

1.3.4 血清miR-29b和miR-135b测定：采用实时荧光定量PCR法检测血清miR-29b和miR-135b水平。按照总RNA提取试剂操作步骤分离提取血清总RNA，并测定其浓度和纯度，按逆转录试剂盒操作步骤逆转录合成cDNA，合成的cDNA保存于-80℃冰箱中。用合成的cDNA模板进行实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR），采用ABI 7500型qRT-PCR仪检测血清miR-29b和miR-135b相对表达水平，内参基因为U6，引物经设计软件设计后由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。荧光定量PCR反应体系共20 µl：cDNA（50 ng/µl）2 µl，qRT-PCR检测使用SYBR Green Master Mix（2×）10 µl，PCR上下游引物（10µmol/L）各1 µl，加ddH2O至20 µl。反应程序为：95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 45s，反应40个循环后，采集数据，采用2-ΔΔCt计算miR-29b和miR-135b基因的相对表达量。

表1 miR-29b，miR-135b和U6 qRT-PCR引物序列

1.3.5 心房纤维化程度检测：158例患者均进行射频消融术，术中留取心肌标本。采用福尔马林固定、石蜡包埋、切片、脱蜡，参考李庆勇等[11]的方法。每张切片随机取10个高倍镜视野，测定每个视野中的胶原面积，计算胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）。根据AF患者心房组织CVF平均数，将患者分为高纤维化组（n=77）和低纤维化组（n=81）。

1.3.6 随访：所有患者术后进行为期6个月的随访，随访方式以电话或者门诊复查方式。随访频次为术后每两个月1次，若患者有心悸等症状及时记录常规心电图及24h动态心电图。复发定义为术后3个月空白期后，24h动态心电图记录≥30s的房颤、房扑或房速。根据患者AF是否复发，分为复发组（n=72）和未复发组（n=86）。

1.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）描述，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以“百分率（%）”表示，组间比较采用卡方检验。采用多因素Logistic回归分析AF患者术后复发的影响因素；受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析血清miR-29b和miR-135b水平对AF患者的术后复发的预测价值，曲线下面积（area under the curve，AUC）比较采用Z检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 对照组与病例组血清miR-29b和miR-135b相对表达水平比较 与对照组相比，AF患者血清miR-29b（0.64±0.13 vs 1.04±0.24）和miR-135b（0.45±0.08 vs 1.00±0.14）的相对表达水平降低，差异具有统计学意义（t=17.916，41.604，均P＜0.05）。

2.2 不同心房纤维化程度患者血清miR-29b和miR-135b相对表达水平比较 与低纤维化患者比较，高纤维化患者的血清miR-29b（0.51±0.11 vs 0.76±0.15），miR-135b（0.34±0.07 vs 0.55±0.09）相对表达水平降低，差异具有统计学意义（t=11.896，16.314，均P＜0.05）。

2.3 AF患者射频消融术后复发组与未复发组临床资料比较 见表2。与未复发组比较，复发组的左心房内径、UA水平增加，差异具有统计学意义（均P＜0.05），其他临床资料差异无统计学意义（均P＞0.05）。

表2 复发组与未复发组临床资料比较[n（%），（±s）]

表2 复发组与未复发组临床资料比较[n（%），（±s）]

类 别复发组（n=72）未复发组（n=86）t/χ2P值性别 男41（56.94）44（51.16）0.5270.468女31（43.06）42（48.84）年龄（岁）67.34±5.2467.14±5.000.2450.807体重指数（kg/m2）23.75±3.5423.35±2.230.8630.389吸烟史40（55.56）42（48.84）0.7090.400高血压史23（31.94）21（24.42）1.1050.296糖尿病史12（16.67）15（17.44）0.0170.897冠心病史14（19.44）13（15.12）0.5180.472 FPG（mmol/L）6.21±1.156.14±1.060.03980.691 LVEF(%)59.23±3.2158.23±4.121.6770.096左心房内径（mm）45.34±3.5635.23±2.8919.7020.001 LDL-C（mmol/L）2.97±0.862.81±0.641.3390.183 TC（mmol/L）3.88±1.163.78±1.080.5600.576 TG（mmol/L）1.53±0.451.51±0.360.3100.757 ALT（U/L）26.47±5.1425.17±4.891.6360.106 AST（U/L）28.14±5.6729.45±5.471..4740.142 CR（μmmol/L） 78.76±20.1774.47±18.451.3950.165 UA（μmol/L） 478.15±68.45421.75±61.765.4410.001 UREA（mmol/L）10.45±2.469.83±2.111.7050.090

2.4 复发组与未复发组血清miR-29b和miR-135b表达水平比较 与未复发组相比，复发组的血清miR-29b（0.54±0.12 vs 0.72±0.14），miR-135b（0.53±0.10 vs 0.36±0.06）的相对表达水平降低，差异具有统计学意义（t=8.584，12.642，均P＜0.05）。

2.5 影响AF患者术后复发的Logistic多因素分析见表3。以AF患者射频消融术后是否复发为因变量（是=1，否=0），左心房直径、UA，miR-29b和miR-135b为自变量，行Logistic回归分析，结果显示，左心房直径、UA，miR-29b和miR-135b是AF患者术后复发的影响因素（均P＜0.05）。

表3 AF患者射频消融术后复发的多因素Logistic 回归分析

2.6 血清miR-29b和miR-135b对AF患者射频消融术后复发的预测价值分析 见图1。miR-29b和miR-135b预测AF患者射频消融术后复发的AUC分别为0.843（95%CI：0.783～0.902），0.901（95%CI：0.852～0.949），miR-29b和miR-135b联合预测的AUC最大，为0.947（95%CI：0.914～0.981），灵敏度分别为65.1%，80.2%和90.75%，特异度分别为88.9%，91.7%和83.1%，具有良好的预测价值。二者联合与血清miR-29b，miR-135b单独检测比较差异无统计学意义（Z=2.288，1.493，P=0.135，0.022）。

图1 血清miR-29b，miR-135b预测AF患者射频消融术后复发的ROC曲线

3 讨论

心房颤动（AF）的典型特征是快速无规律的心跳，可能无症状或出现心悸、呼吸困难和头晕等症状。AF还可能伴有严重的并发症，包括心力衰竭、中风等，甚至可能导致死亡[12]。我国成人的AF患病率为0.77%，随着年龄的增长AF的患病率逐渐升高[13]。射频消融术是临床上AF治疗的最为有效的手段之一，然而术后复发依然是困扰临床工作的常见问题。本文通过对AF患者血清miR-29b和miR-135b的研究，希望发现其预测AF患者射频消融术后复发的价值。

AF患者心房结构重塑突出特征为心房纤维化。心房纤维化即异常胶原纤维在正常心房肌间质中沉积，使正常心房肌间质中胶原纤维含量增加，进而导致心肌间质中不同类型的胶原蛋白比例失调、胶原纤维排列紊乱[14]。miRNAs可对多种疾病及细胞增殖和分化进行调控[15]。有研究表明，miRNAs在调控AF的发生中具有潜在作用，在房颤中，miRNAs参与电重构和结构重构，miRNAs的异常表达可导致AF发生的易患性增加[16]。HAN等[17]研究表明，miR-29b在AF患者的心房组织及心房成纤维化细胞中表达下降，心房纤维化程度加重。YU等[18]研究表明，miR-29b通过抑制Ⅰ型胶原α1（collagen type I alpha chain 1 gene，COL1A1）、Ⅱ型胶原-α1（COL2A1）和Ⅲ型胶原-α1（COL3A1）等胶原合成潜力，参与纤维化的过程。高雅等[19]研究表明，非瓣膜性心房颤动（nonvalvular atrial fibrillation，NVAF）患者外周血miR-29b呈低表达，且miR-29b的表达越低，NVAF的发病风险就越高。贾伟佳等[20]研究表明，miR-135b在多种疾病中参与表达，miR-135b在心律失常性右室心肌病（arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy，ARVC）中表达降低，ROC分析表明miR-135b与ARVC有关。WANG等[21]研究中，miR-135b在大鼠AF组织中表达下调，与大鼠的心房纤维化有关。以上研究均表明血清miR-29b和miR-135b与AF等心血管疾病的发生发展关系密切。本研究中血清miR-29b和miR-135b在AF患者中的表达水平低于对照组，且随着心肌纤维化程度的增加而降低，提示miR-29b和miR-135b可能通过参与心肌纤维化造成心房结构重构而导致AF的发生。分析原因，①miR-29b可调节心房心肌病患者心房TASK-1钾通道表达，miR-29b或可通过miR-29b-VEGFA/TGF-β轴在房颤进展中发挥重要作用[22-23]；②miR-135b能够抑制TGF-β/Smads通路，从而抑制成纤维化细胞的增殖、肌成纤维细胞分化和胶原沉积，抑制心房组织纤维化，从而减轻房颤[21]。本研究接着研究了影响AF患者射频消融术后复发影响因素，发现复发组左心房内径和血清UA水平高于未复发组，提示左心房内径和UA水平可能与AF患者术后复发有关。进一步Logistic多因素回归分析发现，左心房直径、UA增加以及miR-29b，miR-135b降低是AF患者射频消融术后复发的影响因素，提示miR-29b和miR-135b可能在AF患者射频消融术后复发的过程中起保护作用。此外，本文中血清miR-29b和miR-135b预测AF患者射频消融术后复发的AUC分别为0.843，0.901，二者联合预测的AUC为0.923，提示检测血清miR-29b和miR-135b对预测AF患者术后复发有较高的预测效能。故对AF患者血清miR-29b和miR-135b水平的检测有望应用于临床，来预测AF患者术后复发。

综上所述，AF患者血清miR-29b和miR-135b水平降低，二者与AF患者心房纤维化程度及射频消融术后复发相关，对AF患者术后复发有较好的预测价值。本研究中的随访时间较短，不能为长期随访的预后提供较为准确的依据，后续还需延长随访时间并加大样本量，对血清miR-29b和miR-135b水平参与AF患者术后复发的通路及其可能机制进行进一步研究。