副猪格拉瑟菌与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断和防治

田梓翰, 吴 昊, 阮胜男, 任文慧, 吴昊蔚, 何启盖,3

(1. 华中农业大学动物医学院, 湖北 武汉 430000 ; 2. 华中农业大学生猪健康养殖协同创新中心, 湖北 武汉 430000 ;3. 农业农村部兽用诊断制剂创制重点实验室, 湖北 武汉 430000)

副猪格拉瑟菌(Glaesserellaparasuis,G.parasuis)是一种革兰阴性菌,属巴氏杆菌科,是猪上呼吸道中的常在菌之一,在特定情况下可引起猪全身性疾病,主要表现为4～8周龄猪发生纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎,称为格拉瑟病(Glässer's disease)[1],是当前危害养猪业的一种重要的细菌性疾病。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),也称“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种免疫抑制性和高度接触性的传染病。2006年以后出现的类HP-PRRSV毒株和类NADC-30毒株等表现出更强的致病力和传播力,为防控该病带来新的难题[2-4]。猪感染PRRSV可导致免疫细胞损伤,造成机体免疫系统障碍,使机体对其他病原更为易感[5]。临床上常见PRRSV与致病菌混合感染情况,给养殖业带来了严重的经济损失。

本试验对某猪场育肥猪群多种病原混合感染的案例开展综合诊断,根据诊断结果提出用药和防控等相关措施,并评价其防控效果,为广大生猪养殖企业防控相关疫病提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 胰酪大豆胨琼脂培养基(Tryptone soy agar,TSA)和胰酪大豆胨液体培养基(Tryptone soy broth,TSB),均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;犊牛血清,购自浙江天杭生物科技股份有限公司;氧化型辅酶Ⅰ(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD),购自北京索莱宝科技有限公司;猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒苗(R98株),购自湖南中岸生物药业有限公司;复方磺胺间甲氧嘧啶钠注射液,购自成都中牧生物药业有限公司;5%酒石酸泰万菌素预混剂,购自潍坊华英生物科技有限公司;2×TaqMaster Mix,购自北京康为世纪生物科技有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司;Animal Detection U+ Probe qPCR Super PreMix、病毒DNA/RNA提取试剂盒和HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR,均购自南京诺维赞生物科技股份有限公司。

1.2 主要仪器 生物安全柜,海尔生物医疗有限公司产品;核酸电泳仪,北京六一生物科技有限公司产品;CFX Connect荧光定量PCR检测系统和T100 PCR仪,均为美国BIO-RAD公司产品。

1.3 现场调查 调查发病猪场背景信息,观察发病猪临床症状,剖检8头临床症状明显的发病猪,观察并记录其器官病理变化。采集肺脏、脾脏、腹股沟淋巴结和心包积液,用于后续实验室病原检测。

1.4 实验室诊断

1.4.1 细菌分离鉴定 无菌采集剖检病猪的肺脏和心包积液,接种到含NAD和5%犊牛血清的TSA培养基,置于CO2恒温培养箱,37 ℃培养24～48 h后观察结果,挑取单个菌落进行纯化培养。挑取纯化后的单菌落接种到含NAD和10%犊牛血清的TSB培养基,37 ℃摇床过夜培养。吸取200 μL菌液,使用细菌基因组DNA提取试剂盒按说明书操作提取细菌DNA,并通过PCR方法检测副猪格拉瑟菌(Glaesserellaparasuis,G.parasuis)、猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)和支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica,Bb)的DNA片段,PCR所用引物和序列见表1。所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.2 病毒核酸检测 分别采集发病猪的腹股沟淋巴结、脾脏和肺脏组织约1 g,于2 mL EP管中剪碎,加入1 mL Hank's平衡盐溶液进行匀浆处理。匀浆后于-80 ℃反复冻融3次,离心取组织上清液,同一头猪的不同组织上清液合并为1份样品,共得到8份样品,使用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取样品DNA和RNA,并对提取的RNA样品进行反转录处理得到cDNA。对得到的DNA和cDNA进行荧光定量PCR,检测PRRSV、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)和猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)核酸,所用引物和探针序列见表2。所用引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 病毒检测所用引物和探针序列

1.5 防控措施

1.5.1 治疗 结合临床症状、病理变化和实验室检测结果,综合诊断本次疫情为副猪格拉瑟菌和PRRSV混合感染。制定的治疗方案为:全群给药酒石酸泰万菌素(混饮,每1 L水,50～75 mg)和复方磺胺间甲氧嘧啶钠注射液(肌内注射,每次20～30 mg/(kg·bw),1日1～2次,每连用3 d停药1 d),持续给药1周。全群给药1周后,对A和B栋猪群接种PRRSV弱毒苗(R98株),用专用稀释液稀释成每头份2 mL,肌内注射。

1.5.2 评价 猪场每天记录转入数、转出数、死淘数和存栏量,计算各栋舍的周死淘率,直至猪群出栏。采用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计分析,使用t检验对各栋舍免疫前后的周死淘率进行差异显著性检验,以评估该综合防控方案对发病猪场生产成绩的影响。P>0.05表示差异不显著,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 现场调查 该场育肥猪来自于伪狂犬病和猪瘟净化的繁殖场。本育肥场于2021年10月12日陆续转入猪只(约70日龄),10月29日转入结束,该猪群未接种PRRSV疫苗,PCV2疫苗免疫程序为14日龄首免、35日龄加强免疫。猪群转入后,陆续出现猪只精神沉郁,食欲下降,体温升高至41 ℃以上,畏寒扎堆,喜卧,行动不便,咳嗽和喷嚏等症状,部分患猪呈犬坐式呼吸;轻度腹泻,肛周可见黄色稀粪,尿液深黄、氨味重。腹股沟和阴门等柔软部位有蓝紫色淤血斑,体表可见红色斑疹;剖检8头临床症状明显的发病猪,均观察到大叶性肺炎,肺脏肿大充血、质地变硬(图1A),被膜下可见胶冻样物质,肺间质明显增宽,可见多处出血斑相连成片,胸腔纤维素性渗出、积液(图1B);出血性淋巴结炎,腹股沟淋巴结肿大至正常猪的3～4倍(图1C);纤维素性心外膜炎(绒毛心),心包粘连、积液(图1D)。

2.2 实验室诊断

2.2.1 细菌分离鉴定 TSA培养基上长出针尖大小、无色、透明、光滑、湿润的菌落。挑取菌落提取DNA并进行PCR扩增,结果显示,在750～1 000 bp位置可见清晰条带,与副猪格拉瑟菌阳性对照结果一致,阴性对照对应位置未见条带(图2),其他细菌PCR扩增结果均为阴性,表明样品中存在副猪格拉瑟菌。

图2 副猪格拉瑟菌PCR扩增

2.2.2 病毒核酸检测 提取病料核酸得到的DNA和cDNA,进行荧光定量PCR检测,结果显示,8份样品均为PRRSV和PCV2核酸阳性(图3)。

图3 荧光定量PCR检测PRRSV(A)和PCV2(B)

分析临床症状、病理剖检和实验室检测结果,结合猪群的免疫背景进行综合诊断,最终判定本次发病为副猪格拉瑟菌和PRRSV的混合感染。实验室检测虽然检测到PCV2,但考虑猪群已经按程序免疫过2次PCV2疫苗,并结合背景和临床发病表现,故判定PCV2并非本次疾病的主要原因。

2.3 防控措施评价

2.3.1 周死淘率和存栏量 采取防控措施时,A栋猪群处于疫病暴发阶段;B栋猪群开始出现少量发病猪。A和B栋猪群存栏量和周死淘率结果如图4所示,2021年12月11日,A栋猪群突然出现大量咳嗽、喘气和发热的病猪,1周内猪群周死淘率急剧上升至19.85%;2021年12月16日全群投药,1周后周死淘率下降至6.53%;随后,2021年12月23日接种PRRSV弱毒苗,2周后周死淘率下降至1.00%左右,疫病得到有效控制(图4A)。B栋猪群周死淘率维持在3%以下,经2022年12月16日给药和12月23日紧急接种,直至育肥猪出栏,猪群未出现大规模病情(图4B)。说明即使场内相邻猪舍发生PRRS,及时进行全群给药和接种PRRSV弱毒苗,能够有效遏制疾病的发展,降低发病猪死淘率,减轻发病栋舍对相邻栋舍的影响。

图4 猪群周死淘率和存栏量

2.3.2 免疫前后周死淘率对比 A和B栋猪舍免疫前后各4周(2021年11月25日—12月23日和2021年12月23日—2022年1月20日)周死淘率对比结果如图5所示,A栋猪群平均周死淘率由免疫前的7.74%下降至免疫后的1.57%,免疫后的周死淘率与免疫前相比具有极显著差异(P<0.01)。B栋猪群免疫前后的平均周死淘率均维持在2.00%以下,免疫后的周死淘率与免疫前相比未见显著差异(P>0.05),表明接种PPRSV弱毒苗有效地遏制了疾病的继续发展。

图5 免疫前后周死淘率对比

上述结果证明,使用复方磺胺间甲氧嘧啶钠注射液和酒石酸泰万菌素,并紧急接种PRRSV弱毒苗,极大降低了发病猪只死淘率,可有效控制和预防副猪格拉瑟菌和PRRSV的混合感染。

3 讨论

据走访调查,该猪场员工防疫意识淡薄,加上生猪市场行情低迷导致资金紧张,并未及时免疫相关疫苗和进行预防性用药,导致了疾病蔓延扩大,造成了严重的经济损失。各栋舍没有严格执行定人定岗制度,员工在不同栋舍交叉工作;员工为了减小冬季猪舍内的昼夜温差,降低了舍内通风量和送风频率,猪舍内刺激性气体浓度升高,导致猪呼吸系统损伤,从而更容易受到呼吸道病毒和病原菌的侵袭[14,15]。上述问题极大增加了疫病传播和发生的风险。

在本试验中,猪场在使用药物和疫苗的同时,全面加强了饲养管理和生物安全的工作,包括阻断人员和物资在栋舍间的流动、淘汰发病猪、及时通风和控制猪舍内的温湿度和氨气水平、及时清理猪栏中的粪污等措施。研究表明,泰万菌素可以抑制PRRSV复制,缩短PRRSV病毒血症周期,从而减轻PRRSV感染动物的临床症状和减少动物病死率[16,17]。复方磺胺间甲氧嘧啶注射液具有非常高效的广谱抗菌作用,常用于缓解猪无名高热症状[18]。根据本实验室多年来对该猪场抗菌药敏感性监测结果,该场流行的副猪格拉瑟菌对复方磺胺间甲氧嘧啶钠中度敏感。因此,这2种药物被选为该猪场的常备药物。值得注意的是,生产数据表明,接种PRRSV弱毒苗能够有效降低猪群中PRRSV感染后的死淘率,这与先前研究中临床免疫效果观察一致[19,20]。酒石酸泰万菌素和复方磺胺间甲氧嘧啶钠的联合用药,停药后配合使用PRRSV弱毒苗,进一步降低了案例猪场发病猪的死淘率,为防治副猪格拉瑟菌和PRRSV的混合感染提供了方法参考。

养殖企业应坚持“预防为主,防大于治”的原则方针,把生物安全作为疫病防控的第一道防线。谨慎引种,引种后加强检测。严抓舍内卫生环境和通风换气工作,做好猪只的越冬保暖工作。建立科学的消毒、药品和疫苗使用制度,做好各阶段猪只的保健预防工作,提高综合防病水平[21,22];通过提高饲料的营养配比,增加微量元素和益生菌等,增强猪群整体免疫力[23,24],从而保障生产的健康有序性。