个体化新生抗原疫苗治疗微卫星稳定型晚期结直肠癌1例

单娜，俞耀军，林李淼，蔡振寨

1.绍兴市人民医院 消化内科，浙江 绍兴 312000；2.温州医科大学附属第二医院 胃肠外科，浙江 温州 325000；3.温州医科大学附属第二医院 消化内科，浙江 温州 325000

以肿瘤新生抗原为靶点的免疫治疗因其肿瘤特异性和免疫原性强、安全性高而被认为是肿瘤免疫治疗的最优靶点。我们之前的研究探索了基于肿瘤新生抗原的疫苗疗法在小鼠结直肠癌模型中的可行性和有效性[1]，但此类疫苗在人类结直肠癌中尚未见应用。为进一步拓展新生抗原疫苗对晚期微卫星稳定（microsatellite stability, MSS）型结直肠癌（colorectal cancer, CRC）的治疗作用，本研究为1例晚期MSS型CRC患者制备并注射了新生抗原疫苗，研究的初步结果证明了基于肿瘤新生抗原疫苗的可行性及安全性。

1 病例资料

1.1 病史及一般资料 患者，男，40岁，既往体健。2010年3月10日于上海行“结肠癌根治术”，术后病理提示：乙状结肠溃疡型中分化腺癌，侵及全层，周围淋巴结见癌转移（5/18），术后因个人原因未进行辅助化疗及定期随访。2013年复查发现肝、肺转移性肿瘤，随后于扬州武警医院行肝肺转移瘤微波消融术。2019年至温州医科大学附属第二医院行肝、肺穿刺检查，病理免疫组化结果均提示符合结肠癌转移，基因检测提示未测得用药靶点，后接受两次肺转移瘤微波消融术及一次肝转移瘤微波消融术。2019年12月开始接受新生抗原疫苗治疗。本研究涉及人体样本，相应的设计、方案和修改均获得温州医科大学附属第二医院医学伦理委员会的批准（编号：LCKY2018-67）。

1.2 肿瘤新生抗原疫苗制备及注射 使用All-Prep DNA/RNA微型试剂盒（Qiagen, USA/Illumina,USA）从术后肿瘤组织的石蜡切片及外周静脉血中提取DNA和RNA，完成全外显子组DNA和RNA测序。基于MuPeXI（V1.2.0）[2]、NetMHCpan 4.0和变异效应预测器（variant effect predictor, VEP）数据库[3]对DNA突变和人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）进行整合分析，根据HLA结合亲和力、表达水平、与自身肽的相似性和突变等位基因频 率[4-6]，对每个肽进行优先级评分。具有高优先级得分的候选新生抗原将最终被选择用于合成疫苗。

疫苗为27个氨基酸组成的长多肽，以入选的新生抗原突变点为中心，突变点前后各增加13个氨基酸[7-8]。采用标准固相合成肽的原理合成新生抗原多肽，多肽的纯化和纯度分析采用反相高效液相色谱法（reversed phase-high performance liquid chromatography, RP-HPLC）。疫苗的质检包括细菌内毒素、真菌D葡聚糖检测、细菌真菌涂片检查及小鼠异常毒性检测。

拟于患者治疗第1、第4、第8、第15和第22天接受疫苗基础阶段注射，在第12周和第20周接受疫苗加强阶段注射。具体方法为：将疫苗与聚肌胞注射液（广东南国药业有限公司）1:1混匀，在双侧腋下和腹股沟行皮下注射治疗，每次按照逆时针顺序完成4个部位的皮下注射。

1.3 安全性评估 使用国家癌症研究所不良事件共同术语标准（4.0版）进行评分，通过评估临床不良事件的发生率来评估疫苗治疗安全性。患者疫苗注射前后的常规血指标变化也作为安全性评价的客观依据。

1.4 临床监测及干扰素-γ（i n t e r f e r o n gamma, IFN-γ）酶联免疫斑点（enzyme-linked immunosorbent spot, ELISpot）检测 在新生抗原疫苗治疗前后进行临床肿瘤标记物监测。每两个月进行一次增强CT检查，以确定是否存在可测量的肿瘤转移灶。在完成基础阶段及加强阶段的注射治疗后，利用IFN-γ ELISPOT试剂盒（深圳达科为生物科技有限公司）检测新生抗原特异性T细胞中的IFN-γ，评估新生抗原的免疫反应。

1.5 本例患者疫苗治疗的可行性及安全性评估结果 患者于2019年12月至2020年7月完成了8次疫苗注射治疗（见图1）。治疗及随访期间，患者癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）指标降至正常范围并维持11个月（见图2），胸部增强CT显示肺部多发转移灶进展较前控制（见图3）。ELISpot结果显示，新生抗原疫苗治疗后的外周单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）对新生抗原的应答活性显著增强（见图4）。

图1 患者治疗和临床随访图

图2 CEA监测图

图3 肺部转移瘤胸部增强CT图像

图4 疫苗治疗免疫反应监测图

疫苗治疗期间未观察到明显的治疗相关不良事件，常规血检查也未发现明显异常。

2 讨论

经全外显子组测序分析，该患者共测得508个突变肽，根据评分系统其中有246个突变肽被认定为新生抗原，最终有7个新生抗原被选定用于疫苗的合成。患者入组后共接受8次疫苗治疗，在新生抗原疫苗接种期间未观察到明显的不良事件，并且没有因毒性作用而延迟给药。在观察期间，患者CEA指标降至正常范围并维持11个月，胸部增强CT显示肺部多发转移灶进展较前控制。通过监测外周静脉血中的PBMCs，发现疫苗治疗后机体产生了较强的免疫反应。截至临床试验截止日期，患者的无进展生存期（progression-free survival, PFS）已达24个月。上述结果的分析表明，即使是MSS型晚期CRC患者也有望从这种免疫疗法中获益。

目前，我国CRC的发病率在全身恶性肿瘤中居第五位[9]，约20%的CRC首次就诊时已是IV期，其5年生存率仅为13%[10-12]。CRC晚期确诊率高、晚期生存率低已成为不容忽视的现状。由于错失最佳手术机会、放化疗方案单一、可用的靶向药物不多等因素使得晚期CRC患者经常面临“无药可医”的困境。2013年，肿瘤的免疫治疗被Science杂志评为年度十大科学突破之首[13]。目前，基于免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）的免疫疗法已广泛应用于肺癌、转移性黑色素瘤、食管癌等肿瘤的治疗[14-16]。Keynote-177随机III期临床试验表明，使用帕博利珠单抗（pembrolizumab）治疗微卫星不稳定型（microsatellite instabilityhigh,MSI-H）转移性CRC患者的PFS优于化疗，同时影像学评价也显示帕博利珠单抗组的总缓解率和完全缓解率较高[17]。这有力地证明了基于ICIs的免疫疗法在MSI-H型转移性CRC治疗中的临床价值。2015年和2016年，美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology, ASCO）发表了程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1, PD-1）/程序性死亡配体1（programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1）抑制剂帕博利珠单抗和纳武单抗（nivolumab）治疗晚期CRC的临床试验结果。结果表明MSI-H型CRC患者客观缓解率优良，缓解时间较长，药物不良反应可控。然而，占绝大多数MSS型的晚期患者很难从ICIs免疫治疗中获益[18]。因此，破除MSS型晚期CRC患者的免疫抵抗或提出新的免疫治疗方法，成为了CRC免疫治疗研究的热点。

基于新生抗原的肿瘤疫苗已被证明是治疗黑色素瘤和晚期肺癌的安全有效的疫苗[8，19]。相关研究表示基于肿瘤新生抗原的疫苗会触发特异性T细胞对疫苗接种前未检测到的预测新表位的反应，这也有力地证明了存在利用自身免疫系统杀死肿瘤细胞的可能性[20]。目前，一些临床试验已经证明了这些疫苗的安全性和有效性[21]。然而，关于晚期CRC肿瘤个体化疫苗治疗的研究很少。课题组前期将个体化新生抗原疫苗注射到结肠癌小鼠模型体内，初步验证了新生抗原鉴定的可行性、治疗的安全性和有效性[1]。本研究为1例MSS型晚期CRC患者进行新生抗原疫苗治疗，评估了肿瘤疫苗治疗晚期CRC的可行性和安全性，为结直肠癌患者的免疫治疗提供了新的思路。初步结果表明，新生抗原疫苗是一种安全可行的MSS型CRC治疗策略。

然而，我们的临床试验入组患者数量少，且未能进行多中心临床试验，对新生抗原疫苗有效性的评估仍欠完善，这些问题都需要投入更多的时间和精力去解决。