共生培养法促进石杉碱甲增量富集的研究

李 靖,李姝漪,付俊璇,张起辉*

1重庆兴泰濠制药有限公司,重庆 400000;2中南大学材料科学与工程学院,长沙 410083;3重庆大学化学化工学院,重庆 400000

蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb.ex Murray)Trev)为石杉科石杉属蕨类植物,是一种治疗跌打损伤、解毒、止痛以及治疗精神分裂症的珍稀中草药[1]。蛇足石杉也是目前研究较好的用于治疗阿尔茨海默病的药物,其有效成分石杉碱甲是一种治疗重症肌无力和阿尔茨海默病的高效、低毒性、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂,它可以增强乙酰胆碱的作用,而乙酰胆碱是一种与注意力、警惕性、专注力和记忆力有关的中枢神经递质[2,3]。在1982年,石杉碱甲成功从蛇足石杉中分离出来,被当做“希望之星”。据调查,到2025年,发达国家65岁以上的阿尔茨海默病患者将达到710万人,比2018年的550万患者增加近29%,除非有医学上的突破,否则到2050年,该病患者数量可能从550万增加到1 380万[4],而仅在美国,大约每10万人中就有14～20人患有重症肌无力,患者总人数约为36 000～60 000人,这也是一个十分惊人的数字[5]。对于阿尔茨海默病和重症肌无力,目前市面上药物的最大问题是药物毒性以及耐药性。与目前的药物相比,石杉碱甲是天然植物提取物,安全性好、不良反应少、可被人体快速吸收,并且抑制方式为竞争性和非竞争性的混合型抑制,治疗效果显著,有效时间长[6]。

蛇足石杉在世界各地均有分布,但其资源十分有限,其中一个限制因素是蛇足石杉生长缓慢,从孢子到成熟至少需要15年时间。且在成熟阶段蛇足石杉的高度也仅有10～30 cm。同时,其生长环境难以复刻[7],在实际栽培过程中难以推广。因此,在不久的将来,蛇足石杉将面临灭绝的威胁。近年来,对这种珍稀植物开展了多项研究,例如对外植体和愈伤组织的体外培养。Kan′ichiro Ishiuchi的团队先后从H.pinifolia的茎尖中获得外植体,并在灭菌培养基中培养2个周期(每个周期为7 d),最后成功地将外植体转入愈伤组织生长培养基中[8],此外,研究人员对蛇足石杉培养方法进行了各种改进,例如培养基成分筛选以及茎尖培养技术的研究,但组培过程中外植体的消杀问题仍未得到有效的解决,限制了石杉碱甲的大规模化生产[9,10]。由于蛇足石杉的自然资源匮乏以及以上所提及的原因,急需找到一种以较低成本就可提高石杉碱甲含量的新方法。

内生真菌是一类生活在植物茎和叶组织内的真菌,已有研究发现,如果内生真菌与植株长时间共生进化,它们就可以通过基因重组获得宿主植物的某些基因,产生与宿主植物相同的次生代谢物[11-13]。同时,内生真菌还可以产生激素促进寄主植物的生长发育。因此,在共培养体系中,内生真菌被认为是激发子[13],这意味着植物细胞可以在一定浓度范围内与内生真菌共培养,在共培养体系中内生真菌和植物细胞相互影响,促进植物积累产物。麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组成成分,属于真菌类的特征甾醇,可作为衡量真菌生物量的代表性指标[14]。

本研究引入了一种新型的共培养体系(co-culture system,CCS),以一种经济、便捷的方式提高蛇足石杉中石杉碱甲的含量,以改善蛇足石杉因为资源短缺而无法广泛应用的现状。

1 材料与方法

1.1 材料

植株取自湖北省神农架多年生的野生蛇足石杉植株,经重庆大学药学院张传瑞研究员鉴定为石杉科石杉属蕨类植物蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb.ex Murray)Trev),样品(202005006)存于重庆大学植物园室外设施网室内;腐殖土取自重庆市四面山森林公园。

1.2 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪(Agilent有限公司);BDS200型倒置生物显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司);RE-52型旋转蒸发器(上海雅荣生化仪器厂)。

MS培养基(批号:20200406,纯度:BR,杭州百思生物技术有限公司);激动素(KT)(批号:I2020156,纯度≥99%,金坦生物技术分公司);2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)(批号:I1846732,纯度97%,金坦生物技术分公司);青霉素(批号:B184012,纯度98%,北京华迈科生物技术有限公司);链霉素(批号:B160603,纯度90%,北京华迈科生物技术有限公司);两性霉素B(批号:B200208,纯度≥90.0%,北京华迈科生物技术有限公司);特美汀(批号:B173024,纯度≥99%,北京华迈科生物技术有限公司);中性红(批号:20200123,规格:指示剂,天津博迪化工股份有限公司);石杉碱甲(批号:100243-202003,纯度≥98%,四川维克奇生物科技有限公司);麦角甾醇(批号:111845-202004,纯度≥98%,四川维克奇生物科技有限公司);甲醇(批号:2020031702,纯度:色谱纯,天津盾特特种化工有限公司);乙酸铵(批号:2020041323,纯度:色谱纯,成都科隆化工有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 蛇足石杉的驯化

为了获得蛇足石杉最佳培养条件,参考Huang等[15]对蛇足石杉适宜生长环境研究结果,对其驯化条件进行考察。将野生蛇足石杉样本种植于重庆大学室外设施网室内,以蛇足石杉植株的存活率为指标,对驯化时腐殖土与河沙比例、空气湿度、光照强度进行单因素考察,每次试验供试植株为10株,重复3次。植株存活率计算方法为:植株存活率=植株存活数量/供试植株总数×100%。

蛇足石杉在设定的条件下开始发芽(见图1A),即蛇足石杉成功驯化。

图1 萌发的蛇足石杉植株( A ),植株表皮细胞( B )和海绵细胞( C )Fig.1 Germinate Huperzia serrata (A),botanical epidermal cells (B) and spongy cells (C)

1.3.2 组织培养基的制备

以真菌生长情况和叶肉细胞存活率为指标,对培养基制备过程中基础培养基种类(1/2 MS,MS和B5)进行研究[16,17];以丛生芽萌发率和茎段数量为指标考察蔗糖浓度(1%、2%、3%、4%)[17];以愈伤组织诱导率和愈伤组织增殖率为指标考察最佳植物激素2,4-D浓度(0、2、5、7 mg/L)[18]。控制培养基pH为5.8,采用青霉素(30.0 mg/L)、链霉素(50.0 mg/L)、两性霉素B(0.5 mg/L)、特美汀(5.0 mg/L)等抗生素控制培养基中其他微生物的无限增殖,通过分析未植入外植体的灭菌空白培养基的真菌生长情况判断培养基制备过程灭菌是否彻底。愈伤组织诱导率和增殖率的计算方式为:愈伤组织诱导率=诱导出愈伤组织的胚胎数/接种的胚胎数×100%;愈伤组织增殖率=(收获的愈伤组织重量-接种的愈伤组织重量)/接种的愈伤组织重量×100%。

1.3.3 外植体的体外杀菌和繁殖

据报道,蛇足石杉叶片中石杉碱甲的产量最高,因此体外培养的靶细胞为叶肉细胞[16]。将健康叶片用普通肥皂洗净,分别用70%酒精浸泡50 s,0.5 mg/L孔雀石绿浸泡8 min,3%H2O2浸泡10 min,再用无菌水洗涤3次。将灭菌后的外植体在含有5～10 mL液体灭菌介质的研钵中机械粉碎。1～3 min后,将叶肉细胞悬液转入容量瓶中稀释,然后转入培养基中,在室温(24 ℃),光照强度(100 Lux左右),湿度(95%)下培养[19]。

1.3.4 单细胞计数

每2 d测定一次叶肉细胞数。样品以4∶1的比例悬浮于含0.04%中性红的沉积物中,孵育20 min后,用血细胞计计数染色活细胞。

在显微镜下,可以清晰地观察到悬浮液中的表皮细胞和海绵状细胞(见图1B、1C)。海绵状细胞中的石杉碱甲的浓度最高,其成像长约23～38 μm,宽约15～23 μm[20]。

1.3.5 提取

取5 mL培养基悬液,通过3次冻融提取,2次超声提取(单次40 min,每次间隔10 min)提取石杉碱甲和麦角甾醇[21]。将悬液减压蒸馏浓缩,提取液用甲醇溶解。将溶液转移到10 mL容量瓶中定容。在HPLC分析前溶液用0.22 μm滤膜过滤。

每天测定一次石杉碱甲和麦角甾醇的浓度和混合比例。

1.3.6 色谱条件

采用高效液相色谱仪和紫外检测器对提取物进行色谱分析。色谱柱:Agilent TC-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),进样量10 μL,流速1.0 mL/min,柱温25 ℃。石杉碱甲和麦角甾醇的检测波长分别为310 nm和282 nm。流动相由水和甲醇(含0.008 mol/L乙酸铵)组成,比例为75∶25[22,23]。

1.3.7 方法验证

以5～45 μg/mL石杉碱甲和麦角甾醇标准溶液绘制标准曲线。采用相关系数法(r)测定标准曲线的线性度。

精密度试验:在相同条件下,将标准溶液(10 μg/mL)进样5次,测定方法精密度。重复性试验:样品在相同条件下操作5 次,测试方法重复性。稳定性实验:样品分别于1、2、4、8、12 h测定,测试方法稳定性[24]。以上三种试验结果均以峰面积的相对标准偏差(RSD,%)表示。取已测定石杉碱甲和麦角甾醇含量的样品(1 mL)加入石杉碱甲(0.5 mL,10 μg/mL)和麦角甾醇(1 mL,15 μg/mL)在“1.3.6”的色谱条件下进行加标回收试验,重复5次,计算回收率,并根据回收率进行评价:回收率=(加标试样测定值-样品测定值)/加标量×100%。

1.4 数据处理方法

2 结果与分析

2.1 驯化条件考察

为了研究共培养体系最佳培养条件,对蛇足石杉驯化条件进行了单因素考察,并选取各因素考察试验中存活率较高的三组进行显著性差异分析。如图2A所示,土壤由腐殖土和河沙组成,在不同土壤配比下植株存活率存在显著差异,土壤配比为2∶1时植株存活率最高,并且2∶1与1∶1之间的P值小于0.01,2∶1与4∶1之间的P值小于0.05,故选取2∶1作为最佳土壤配比。在最佳光照强度研究中,不同光照强度下植物存活率存在着显著差异,见图2B,100 Lux与300 Lux之间的P值小于0.01,100 Lux与80 Lux的P值小于0.05,最佳光照强度为100 Lux。由图2C可知,空气湿度对植物存活率也存在着显著影响,95%与85%和95%与100%之间的P值均小于0.01,最佳空气湿度为95%。

图2 驯化条件对植株存活率的影响Fig.2 Effect of domestication conditions on plant survival rate 注:*P < 0.05;**P < 0.01。

2.2 不同培养基条件研究

由表1结果所示,空白对照组在相同培育条件下未见真菌污染物,表明培养基制备过程中灭菌彻底,只有使用MS培养基时,叶肉细胞存活率为12.5%,并且伴随着内生真菌的生长,说明基础培养基的种类对蛇足石杉内生真菌的生长和细胞培养体系有显著影响;改变培养体系蔗糖浓度,丛生芽萌发率和茎段数量发生明显变化,在蔗糖浓度为(2%)20.0 g/L时,丛生芽萌发率和茎段数量最高;添加植物激素有利于蛇足石杉愈伤组织的诱导,在5.0 mg/L时诱导率最佳,但植物激素对愈伤组织增殖有着不利影响,随着植物激素浓度增加增殖率不断减小,综合选择5.0 mg/L 2,4-D作为最适浓度。因此,最佳培养基条件为MS液体培养基,蔗糖(20.0 g/L)、2,4-D(5.0 mg/L)和KT(1.0 mg/L)。

表1 培养条件对比结果

2.3 共培养体系指标性成分含量测定

我们采用机械破碎法制得蛇足石杉的叶肉细胞悬液。在CCS过程中,内生真菌的增殖被控制在一定的范围内,以维持叶肉细胞和内生真菌之间的平衡,而其他类型的微生物则受到抗生素的有效抑制。通过HPLC检测培养体系内石杉碱甲和麦角甾醇含量,探究内生真菌生长对石杉碱甲富集的影响。石杉碱甲是蛇足石杉的主要活性成分,反映了叶肉细胞的数量。而麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组成部分,是衡量生物量的代表性指标[25]。

按照上述原则,对提取物进行色谱分析。石杉碱甲和麦角甾醇的代表性色谱图见图3。A和B图分别显示了石杉碱甲和麦角甾醇在培养基中的相应色谱峰和结构,在相同色谱条件下,标准品2个峰的基线分离时间分别为9.31 min和10.95 min。通过提取物与对照品进行对比,证明提取物中存在石杉碱甲和麦角甾醇。

图3 标准品与样品HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of standards and samples

图4A显示石杉碱甲和麦角甾醇浓度随时间的变化规律。由图分析可知,在6 d时石杉碱甲上升至最高水平,麦角甾醇下降到最低水平,在12 d时,麦角甾醇浓度达到峰值。这两种特征化合物的峰值浓度不是同步的,石杉碱甲比麦角甾醇更早达到峰值浓度,说明当石杉碱甲与麦角甾醇的浓度比在2.2～1.5之间时,内生真菌的生长对石杉碱甲富集具有促进作用。

图4 分析指标随时间的变化Fig.4 The change of analysis indicators with time注:*P < 0.05;**P < 0.01。

图4B展示了蛇足石杉细胞数量随培养周期的变化规律,植物细胞在4 d内生长稳定,在第4 d时每体积细胞计数中活细胞数为8个,达到最大值,随后细胞数量开始下降,通过对第4 d与第2 d以及第6 d之间的显著性差异分析,发现4 d时的活细胞数量显著高于2 d和6 d时的数量,因此初步确定第4 d为采收和继代的最佳时间点。

为进一步验证采收和继代的最佳时间,采用HPLC法测定石杉碱甲在1～6 d的含量,每天取样1次。由图4C可知,在蛇足石杉植物细胞与内生真菌的共培养体系中,石杉碱甲含量在1～4 d内逐渐增加,达到最大值13.68 μg/mL,4 d后石杉碱甲含量呈现降低趋势,表明第4 d是石杉碱甲含量变化的拐点。通过拐点与相邻两天含量之间的显著性差异分析,第4 d与第5 d的P值小于0.05,第4 d与第3 d的P值小于0.01,说明4 d时石杉碱甲含量显著高于相邻两天时的含量,因此认为第4 d是石杉碱甲采收和继代的最佳时间。经过4 d共培养之后石杉碱甲含量较1 d 时的9.16 μg/mL增长了49.34%。

2.4 检测方法学研究

方法学研究结果如表2所示,经计算,石杉碱甲和麦角甾醇浓度分析精密度RSD分别为0.81%和1.07%,重复性分别为1.36%和2.7%。说明方法精密度和重复性良好,稳定性RSD分别为1.33%和2.45%,说明方法稳定,两种分析物的回收率分别为101.81%和100.01%,并且RSD小于5%,说明测试方法结果准确。

表2 方法线性度

3 讨论与结论

石杉碱甲是一种用于治疗老年痴呆和重症肌无力的AChE抑制剂,其主要来源是蛇足石杉,但石杉碱甲在蛇足石杉中含量较低,并且蛇足石杉资源有限,限制了石杉碱甲在医药领域的进一步发展[3]。有研究表明,在植物体内存在着多种内生真菌,它们在长期的进化过程中与宿主植物形成了一种复杂的互利共生关系,一方面,内生真菌需要从植物中吸取营养,以满足自身生存[26]。另一方面,内生真菌为了抵抗宿主的防御系统,与宿主植物产生了特殊的生物化学交流,可通过识别宿主的化学信号或者雇用宿主酶系来合成与宿主相似的次级代谢产物[27]。如Jiang等[28]在半红树植物黄槿中通过分离纯化内生真菌,固体发酵得到了与宿主相同的次生代谢产物。Tong等[29]通过对蛇足石杉内生真菌FS4次级代谢产物的分离研究,发现其5种代谢产物表现出与石杉碱甲相似的强抑制乙酰胆碱酯酶生物活性。

本研究中对野生蛇足石杉的驯化条件和组织培养基条件进行了试验,确定了最佳培养条件为光照强度100 Lux,湿度95%,MS液体培养基,蔗糖20.0 g/L,2,4-D 5.0 mg/L和KT 1.0 mg/L,并以石杉碱甲和麦角甾醇这两种化合物的相对变化趋势来反映CCS的动态生长过程,由其拐点确定第4 d为采收和继代的最佳时间。通过CCS培养4 d之后,石杉碱甲的含量提升了49.34%,达到最大值,培养体系内石杉碱甲含量总体呈现先上升后下降的趋势,这是由于在生长后期内生真菌的繁殖能力比植物细胞分化能力更强,抢夺了培养基中的营养成分和生长空间,导致细胞数量减少,所以采收和继代时间的选择是共培养体系实现石杉碱甲增量富集的关键,同时植物激素2,4-D浓度对体系有着较大的影响,2,4-D对植物器官的脱分化、愈伤组织的诱导具有促进作用,但浓度过高时对细胞的分化有抑制作用,所以在培养体系中,采用5 mg/L作为最适浓度[30]。本实验成功采用共培养体系实现石杉碱甲的生物合成,此方法克服了传统的固定观念,因为植物体细胞培养不需要事先彻底灭菌,植物体细胞与内生真菌可以实现共培养,并且在特定比例下可以促进石杉碱甲的生成。只要准确掌握培养周期规律,就可以利用这种方便快捷的方法积累石杉碱甲,对保护植物资源和丰富石杉碱甲重要的生物活性物质具有重要意义。