HS-SPME-GC-MS分析柴胡、白芍配伍前后挥发性组分变化规律

张心一,江汉美,成 立,刘 毅

湖北中医药大学药学院 湖北省药用植物研发中心,武汉430070

中药药对是组方用药的最小单元,药对的配伍主要遵循同气相求、相辅相成、相反相成、相制为用的规律[1]。白芍养肝柔肝、柴胡疏肝解郁,二药相合,共奏疏达肝气,养血柔肝之功,白芍与柴胡配对,亦具有相反相成的配伍关系,白芍养血,防柴胡疏散太过而劫肝阴,柴胡和散,防白芍酸寒而肝气结也。既得疏肝解郁,相须为伍,又相辅佐,取长补短,二药相配形成逍遥散、四逆散、大柴胡汤、柴胡疏肝散等方。柴胡为伞科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)或狭叶柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)的干燥根[2]。白芍为毛茛科植物芍药(PaeonialactifloraPall.)的干燥根[2]。查阅相关文献发现,已有研究采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析柴胡、白芍挥发性成分[3-5],而到目前为止,还未有采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)与气相色谱-质谱联用法(GC-MS)联用分析柴胡、白芍配伍前后挥发性成分的报道。HS-SPME应用广泛[6],具有高效、便捷的特点。本研究采用HS-SPME-GC-MS技术,结合主成分分析(PCA)等数据分析方法,对柴胡和白芍的挥发性成分及其配伍前后挥发性组分的变化规律进行研究,为进一步深入探究此药对的配伍机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柴胡(Radix Bupleurum,RB)和白芍(Radix Paeoniae Alba,RP)药材由湖北中医药大学黄家湖医院提供,经湖北中医药大学中药鉴定为伞形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)的干燥根及毛茛科植物芍药(PaeonialactifloraPall.)的干燥根。

手动固相微萃取(SPME)进样装置(德国IKA公司);ThermoFisher Trace 1310型气相质谱联用仪(美国ThermoFisher公司);顶空瓶(规格:15 mL);聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取纤维头(规格:65 μm,美国Supelco公司);ALC-210.2型电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

1.2 样品处理

先将柴胡、白芍样品置于冷冻干燥机中干燥,然后分别用打粉机粉碎,过16目筛备用。

1.3 GC-MS条件

GC条件:色谱柱为TG-1701MS毛细管柱;升温程序:从50 ℃开始,保留2.5 min以10 ℃/min升温至250 ℃;载气:高纯度He(99.999%);柱流速:1.0 mL/min;进样口温度:250 ℃。

MS条件:EI源;电子能量70 eV,温度250 ℃。采用全扫描模式采集数据,扫描范围40～600。

1.4 萃取方法

精密称取柴胡-白芍药对混合粗粉0.8 g(柴胡、白芍粉末各0.4 g),置于15 mL顶空瓶中,插入装有65 μm PDMS/DVB萃取纤维头的手动进样器,在100 ℃下平衡10 min后,再压缩手柄伸出萃取头萃取15 min,取出,立即插入气相色谱仪进样口(温度250 ℃)解析3 min。单味药材实验条件同上。

1.5 数据处理方法

采用峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量,并通过Mainlib质谱数据库对获得的质谱图进行检索,以鉴定各组分。以SPSS 21.0软件对柴胡、白芍及其药对的挥发性成分及其相对百分含量进行主成分分析(PCA)。

2 结果

按上述HS-SPME和GC-MS条件分析柴胡、白芍配伍前后挥发性成分的变化,采用峰面积归一化法,将数据导入安捷伦化学工作站进行处理,并计算各组分相对百分含量,在Mainlib质谱数据库中按各峰的质谱图进行检索,查阅相关文献初步鉴定出111种化合物,化学成分鉴定结果见表1,柴胡、白芍及药对的总离子流图见图1。

图1 柴胡、白芍及其药对挥发性成分总离子流图Fig.1 Total ionchromatogram of volatile components in RB,RP and RB-RP

表1 柴胡、白芍及柴胡-白芍药对挥发性成分

2.1 柴胡、白芍及其药对的挥发性成分分析结果

2.1.1 柴胡、白芍及其药对的挥发性组分的定量分析

从柴胡药材粉末分离鉴定出61个挥发性成分;从白芍药材粉末分离出50个挥发性成分;柴胡-白芍药对药材粉末分离鉴定出61个挥发性成分;柴胡、白芍及其药对鉴定出的挥发性成分含量分别占总挥发性成分含量的93.04%、92.14%和95.21%。

2.1.2 药对与单味药之间挥发性成分的比较与分析

在柴胡中鉴定出了61种挥发性成分,其中最主要的成分是(+)-β-柏木萜烯(30.41%)、异丁香烯(6.31%)、正十三烷(5.42%);在白芍中鉴定出了50种挥发性成分,其中最主要的成分是α-姜黄烯(10.17%)、草蒿脑(7.66%)、桃金娘烷醇(6.17%);在柴胡-白芍药对中鉴定出了61种挥发性成分,其中最主要的成分是(+)-β-柏木萜烯(25.01%)、1,8,11,14-十七碳四烯(6.50%)、十五烷(5.59%)、α-姜黄烯(4.62%)。柴胡和药对的共有成分为27个,主要为(+)-β-柏木萜烯、异丁香烯、冰草烯、叩巴烯等;白芍和药对的共有成分为7个,主要为γ-古芸烯、β-瑟林烯、1,8,11,14-十七碳四烯、1,8,11-十七碳三烯等;柴胡、白芍及药对的共有成分为11个,主要为α-姜黄烯、β-红没药烯、β-瑟林烯、氧化石竹烯等,结果见表1。

2.1.3 柴胡、白芍及其药对挥发性成分种类和含量的差异

由表1得,挥发性成分主要分为烯类、酯类、酮类、醛类、酸类、醇类、烷烃类及其他类化合物。烯类成分在柴胡、白芍及其药对挥发性成分相对百分含量中占比最高,其中柴胡挥发性成分中烯类成分占比为54.49%,白芍挥发性成分中烯类成分占比为58.95%,药对挥发性成分中烯类成分占比为64.17%,三者挥发性成分种类和含量见表2。

表2 柴胡、白芍及药对挥发性成分种类和相对含量的分析

2.2 柴胡、白芍及其药对挥发性成分的PCA

由表1可知,柴胡、白芍及其药对三者的挥发性成分含量数据较为分散,拟通过主成分分析(PCA)将离散的数据进行标准化处理。采用SPSS 21.0统计软件对3组样品的111种挥发性成分含量进行PCA。特征值和贡献率见表3,各成分的主成分特征向量及载荷矩阵见表4。从表3和表4可以看出,第一主成分的贡献率为67.001%,它主要反映了醇类、酯类、烷烃类3类组分的变化信息,并且第一主成分与醇类化合物之间存在正相关,而与酯类化合物和烷烃之间存在负相关关系;第二主成分的贡献率为32.999%,与酸类化合物存在正相关关系,与烯类化合物存在负相关关系,两个主成分的累计贡献率达到100.000%,较好地反映了样本的总体信息。以F1和F2两个新的综合指标来代替原来的8类成分所表达的信息,综合得分F=67.001%Y1+32.999%Y2,得到综合得分值表5。PCA结果如图2所示,单味药材和药对的综合评分具有较大差异,柴胡-白芍药对挥发性成分的得分明显高于单味药材。综合得分越高,表明挥发性成分含量越多,因此可以认为主成分在该组总挥发性成分含量的比重也越高。从挥发性成分的角度来看,柴胡-白芍药对配伍后具有最丰富的挥发性成分。

图2 柴胡、白芍及其药对PCA分析得分图Fig.2 PCA analysis scores of RB,RP and RB-RP

表3 主成分分析的特征值及其贡献率

表4 主成分的特征向量和载荷矩阵

表5 柴胡、白芍及其药对挥发性成分主成分得分和综合得分

3 讨论与结论

本研究采用HS-SPME-GC-MS法对柴胡、白芍及柴胡-白芍药对的挥发性成分进行测定分析,柴胡-白芍药对特有的挥发性组分为16个,与柴胡有27个共有挥发性组分,与白芍有7个共有挥发性组分。

将药对与单味药的挥发性成分含量进行对比可得,药对挥发性成分含量较单味药有所提高的成分有15种,包括α-姜黄烯、β-红没药烯、氧化石竹烯、紫穗槐二烯、(+)-β-柏木萜烯等。药对中挥发性成分含量较单味药有所降低的成分有15种,包括十二烷、苯甲醇、十六烷、十九烷等。同时,药对新增了16种新的挥发性成分,包括马鞭烯酮、反式石竹烯、α-荜澄茄油烯、瓦伦亚烯、前列腺素E1等。与单味药相比,药对中含量增加的(+)-β-柏木萜烯是侧柏精油的主要成分[7],具有抗菌消炎、收敛、利尿、柔软、化痰、杀霉菌等作用;α-姜黄烯具有比较强的抗菌活性[8];β-红没药烯对多种乳腺癌细胞有抑制作用[9];氧化石竹烯具有平喘、抗肿瘤、抗菌和镇咳作用[10]。并且,二药配伍后新增加的成分如反式石竹烯、α-荜澄茄油烯、前列腺素E1等,反式石竹烯具有一定的平喘、抗菌作用[14],产生的α-荜澄茄油烯具有良好的抑菌作用[15],前列腺素E1具有良好的抗炎作用[16],与柴胡-白芍配伍的临床应用相符。此外,药对中含量降低的成分如十二烷具有低毒性[11];苯甲醇对中枢神经系统有毒性[12];十六烷蒸气会对人体上呼吸道、眼和皮肤产生刺激性[13]等,这些有害成分在二药配伍后含量均有所降低。从挥发性成分的角度出发可得柴胡-白芍配伍后有减毒增效的作用,如经典中药制剂安乳消痛丸,柴胡和白芍作为其中主要成分,二药合用,既能疏肝解郁以治肝用之不达,又能柔肝益阴以补肝体,有养血敛阴,缓解疼痛之功效[17]。

有研究[18]采用索氏、微波、水蒸馏、超临界CO2-水蒸气蒸馏提取法提取柴胡挥发油并定性化学成分,共分析鉴定其所得挥发性成分分别为34、21、25、19种,本研究采取HS-SPME分离定性的柴胡挥发性成分为61种,采用HS-SPME-GC-MS联用技术可提高药物挥发性成分的提取率,与文献中所用的方法相比,药物的出峰数和挥发性物质含量更高,表明顶空固相微萃取萃取药物挥发性组分具有高效灵敏的特性。

综上所述,柴胡、白芍配伍使用在临床上运用广泛。但鲜有柴胡、白芍及其药对挥发性成分的研究。本实验应用HS-SPME-GC-MS技术测定柴胡、白芍以及柴胡-白芍药对挥发性成分,通过面积归一法确定各成分百分含量,从挥发性成分角度出发,分析柴胡-白芍药对配伍前后化学成分的变化,根据配伍规律,探讨柴胡-白芍药对的配伍作用,以期进一步挖掘其疗效机理。