草果果实的化学成分及其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究

吕福杰,路继刚,范在举,邓爱霞

1聊城市中医医院;2聊城大学材料科学与工程学院,聊城 252000

草果Amomumtsao-koCrevost &Lemarie为姜科豆蔻属多年生草本植物,主要分布于中国云南、广西、贵州等省。果实入药,具有燥湿健脾,除痰截疟的功能;也可作为调味香料,提取芳香油,是一类药食两用的品种[1]。作为国内较为常见的药食同源品种,草果的化学成分及药理作用得到了较为广泛的研究:化学成分方面,除去挥发油类成分外,主要包括黄酮类[2]、酚类[3]、二苯基庚烷类成分[4]等,其中黄酮类化合物多以抗炎及抗氧化活性、酚类化合物多以抗氧化活性、二苯基庚烷类化合物多以抗肿瘤及抑制α-葡萄糖苷酶活性被广泛报道[5]。

糖尿病是一种以高血糖为特征,具有多种并发症的代谢性疾病,近年来已成为仅次于心脑血管疾病和癌症的第三位“健康杀手”。α-葡萄糖苷酶抑制剂可以通过降低餐后血糖峰值,控制糖尿病的发展尤其是并发症的发生,是一种有广阔应用前景的糖尿病治疗药物。阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇是目前临床应用最广泛的α-葡萄糖苷酶抑制剂,但价格昂贵,具有消化道障碍、低血糖导致休克等副作用,而且对糖尿病并发症不能起到有效的治疗,发掘新型α-葡萄糖苷酶抑制剂有着重要意义。研究表明草果的干粉及提取物具有降血糖功能及抑制α-葡萄糖苷酶相关活性[6,7],但并无其中单体成分对降糖的相关研究。本研究通过对草果进行系统的提取分离,发现其中单体成分以丰富该物种化学成分多样性,并挖掘其中具有抑制α-葡萄糖苷酶的化合物,有望为传统中药的临床用途提供新思路。

2 材料与方法

1.1 仪器与材料

Autopol I自动旋光仪(美国Rudolph Research Analytical公司); Waters-Micromass Q-TOF electrospray质谱仪;圆二色谱仪(英国Applied Photophysics公司);AvanceIII-600 MHz核磁共振仪(瑞士Bruker公司)。柱色谱硅胶及GF254薄层色谱硅胶(青岛海洋化工厂);Sephadex LH-20(美国GE公司);反相硅胶(德国Merck公司);CHP-20 MCI(日本Mitsubishi公司)。石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇等溶剂(分析纯,天津大茂化学试剂厂)。

药材于2019年采购于安徽亳州药材市场,经聊城市中医院范在举主管中药师鉴定为豆蔻属植物草果(Amomumtsao-koCrevost &Lemarie)的果实,标本(编号:CG2019)储存于聊城市中医院中药制剂中心。

1.2 实验步骤

1.2.1 提取与分离

对烘干后的3 kg草果果实进行粉碎,用95%乙醇提取三次(5.0 L×3),浓缩后除去乙醇,得到粗浸膏(200 g)。将粗浸膏用水混悬,分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到三个不同极性部位的浸膏,对乙酸乙酯部位(90 g)进行系统分离:浸膏经MCI柱层析(甲醇∶水 = 4∶6→9∶1)洗脱为12个馏分(Fr.A～Fr.L)。其中Fr.C段经反相硅胶柱色谱进行梯度(甲醇∶水 = 3∶7→7∶3)洗脱分为两个馏分(Fr.C1和Fr.C2),Fr.C1经高效液相色谱仪(50%甲醇/水,3mL/min)进行分离得到化合物3(1.3 mg,tR= 12 min)和5(1.4 mg,tR= 15 min);Fr.C2经高效液相色谱仪(55%甲醇/水,3 mL/min)进行分离得到化合物4(0.9 mg,tR= 11 min)和6(1.6 mg,tR= 14 min)。Fr.E段经硅胶柱色谱进行梯度(石油醚∶乙酸乙酯 = 2∶1→1∶3)洗脱分为三个馏分(Fr.E1～E3),Fr.E1经凝胶色谱(100%乙醇)纯化后经高效液相色谱仪(50%甲醇/水,3mL/min)进行分离得到化合物10(2.3 mg,tR= 9 min)和11(4 mg,tR= 11 min)。Fr.E3经凝胶色谱(100%甲醇)纯化后经高效液相色谱仪(70%甲醇/水,3mL/min)进行分离得到化合物8(5 mg,tR= 9 min)和9(4 mg,tR= 11 min)。Fr.G段经硅胶柱色谱进行梯度(石油醚∶丙酮=10∶1→2∶1)洗脱后再经凝胶色谱(氯仿∶甲醇 = 1∶1)纯化得到化合物7(2 mg)。Fr.H经凝胶色谱(100%甲醇)纯化后经高效液相色谱仪(80%甲醇/水,3mL/min)分离得到化合物1(1 mg,tR= 15 min)和2(1 mg,tR= 16 min)。

1.2.2 化合物1的ECD计算

采用Maestro 10.2中的构象搜索功能,采用MMFFs力场计算构象能量,挑选能量阈值在2.5 kcal/mol以内的构象进行量子化学几何优化。然后采用Gaussian 09在B3LYP-6-311G(2d,q)对得到的构象进行几何优化以及TD-DFT方法计算每个优势构象的激发态。最后采用SpecDis软件拟合化合物的ECD图谱,并与实验图谱比对。

1.2.3α-葡萄糖苷酶活性成分的筛选方法

1.2.3.1α-葡萄糖苷酶抑制活性检测方法

本检测按照Zhang等[8]的方法进行操作,以阿卡波糖作为阳性对照药物,按照公式计算抑制率:抑制率=[1- (A样品-A空白) / (A阴性-A空白) ]×100%,实验数据利用数据分析软件Graph Pad Prism 8.0进行处理并求出相应IC50值,结果通过至少3次平行实验获得,实验值表示为数值为平均值±标准差(¯x±s)。进一步对所得IC50值应用Graph Pad Prism 8.0软件进行统计学分析,用单因素方差分析(One-wayANOVA)计算统计学差异,以P<0.01表示存在显著性差异。

1.2.3.2 酶动力学的测定

活性化合物与的抑制类型活性根据之前描述的方法[9]进行评估。在加入或不加入IC50值附近四种不同浓度的受试化合物的情况下,增加底物PNPG的浓度。所研究化合物结合α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型是通过Lineweaver-Burk曲线进行分析得出。

2 实验结果

2.1 结构鉴定

图1 化合物1～11的结构Fig.1 The chemical structures of the compounds 1-11

图2 化合物1的关键1H-1H COSY(━)和HMBC(→)相关Fig.2 Key1H-1H COSY(━)and HMBC(→)correlations of compound 1

图3 化合物1的计算ECD及实测ECD图Fig.3 Calculated and experimental ECD spectra of 1

表1 化合物1的1H和13C NMR数据(600 MHz和150 MHz,CDCl3)

化合物2无色油状物;ESI-MS:m/z249.1 [M+Na]+,分子式为C12H18O4;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.51(2H,s,H-2,6),3.91(1H,m,H-7),3.89(6H,s,3,5-OMe),3.21(3H,s,4-OMe),1.81(1H,m,H-8b),1.63(1H,m,H-8a),0.87(3H,t,J= 7.4 Hz,H-9);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:133.4(C-1),103.2(C-2,6),147.0(C-3,5),133.8(C-4),85.8(C-7),31.0 (C-8),10.3(C-9),56.3(3,5-OMe),56.5(4-OMe)。以上数据与文献[10]报道基本一致,故鉴定化合物2为(R)-1-(3,4,5-trimethoxyphenyl)propan-1-ol。

化合物3无色油状物;ESI-MSm/z:179.2 [M+H]+,分子式为C10H12O3;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.55(1H,d,J= 1.9 Hz,H-2),7.55(1H,dd,J= 8.7,1.9 Hz,H-5),6.94(1H,d,J= 8.7 Hz,H-6),3.95(3H,s,3-OMe),2.96(2H,q,J= 7.3 Hz,H-8),1.22(3H,t,J= 7.3 Hz,H-9);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:129.9(C-1),109.7(C-2),146.8(C-3),150.1(C-4),113.7(C-5),123.2(C-6),199.6(C-7),31.3(C-8),8.6(C-9),56.1(3-OMe)。以上数据与文献[12]报道基本一致,故鉴定化合物3为3-甲氧基-4-羟基苯丙酮。

化合物4无色油状物;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.54(1H,d,J= 1.8 Hz,H-2),7.54(1H,dd,J= 8.6,1.8 Hz,H-5),6.94(1H,d,J= 8.6 Hz,H-6),3.95(3H,s,3-OMe),2.56(3H,s,H-8);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:130.2(C-1),109.7(C-2),146.6(C-3),150.4(C-4),113.8(C-5),124.0(C-6),196.8(C-7),26.2(C-8),56.0(3-OMe)。以上数据与文献[13]报道基本一致,故鉴定化合物4为香草乙酮。

化合物5无色油状物;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.39(2H,s,H-2,6),3.87(6H,s,3,5-OMe),2.30(3H,s,H-7);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:132.4(C-1),105.6(C-2,6),146.8(C-3,5),128.8(C-4),21.6(C-7),56.3(3,5-OMe)。以上数据与文献[14]报道基本一致,故鉴定化合物5为2,6二甲氧基-4甲基苯酚。

化合物6无色油状物;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:9.67(1H,s,H-7),7.09(2H,m,H-2,5),6.88(1H,m,H-6),3.81(3H,s,3-OMe);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:130.0(C-1),108.7(C-2),147.2(C-3),151.7(C-4),114.4(C-5),127.6(C-6),190.9(C-7),56.2(3-OMe)。以上数据[12]与文献报道基本一致,故鉴定化合物6为香兰素。

化合物7无色油状物;1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.30(1H,brs,H-4),1.68(3H,brs,H-10),0.95(3H,d,J= 7.3 Hz,H-8),0.92(3H,d,J= 7.3 Hz,H-8);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:133.8(C-1),118.4(C-2),34.5(C-3),71.8(C-4),30.8(C-5),27.1(C-6),36.8(C-7),16.8(C-8),16.8(C-9),23.3(C-10)。以上数据与文献[15]报道基本一致,故鉴定化合物7为4-萜烯醇。

化合物8无色油状物;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:5.77(2H,m,H-11,12),5.46(2H,m,H-15,16),0.97(3H,t,J= 7.5 Hz,H-18);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:176.0(C-1),34.8(C-2),26.0(C-3),26.5(C-4),30.1(C-5),30.3(C-6),30.5(C-7),38.3(C-8),73.0(C-9),136.5(C-10),131.1(C-11),75.9(C-12),75.8(C-13),31.5(C-14),134.3(C-15),126.4(C-16),21.7(C-17),14.6(C-18),52.0(1-OCH3)。以上数据与文献[16]报道基本一致,故鉴定化合物8为methyl (9S,10R,11E,13R,15Z)-9,10,13-trihydroxyoctadeca-11,15-dienoate。

化合物9无色油状物;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:5.70(2H,m,H-11,12),0.91(3H,t,J= 7.5 Hz,H-18);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:176.0(C-1),34.8(C-2),26.0(C-3),30.1(C-4),30.4(C-5),30.5(C-6),26.6(C-7),33.5(C-8),75.8(C-9),76.5(C-10),136.5(C-11),131.1(C-12),73.0(C-13),38.3(C-14),26.5(C-15),33.1(C-16),23.7(C-17),14.4(C-18),52.0(1-OMe)。以上数据与文献[16]报道基本一致,故鉴定化合物9为methyl (9S,10R,11E,13R)-9,10,13-trihydroxyoctadec-11-enoate。

化合物10无色胶状物;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.63～7.00(9H,m,H-2′,2′′,2′′′,5′,5′′,5′′′,6′,6′′,6′′′),5.48(1H,d,J= 2.5 Hz,H-1),5.01(1H,d,J= 5.7 Hz,H-7′′′),4.25(1H,dt,J= 7.6,6.5 Hz,H-3),3.84(3H,s,3′′′-OMe),3.83(3H,s,3′′-OMe),3.73(3H,s,3′-OMe),3.71(1H,dt,J= 8.2,3.6 Hz,H-6),3.66(1H,dt,J= 8.2,3.6 Hz,H-5),3.50(1H,dd,J= 9.5,5.8 Hz,H-9′′′),3.04(1H,ddd,J= 10.1,7.8,2.5 Hz,H-2),2.84(1H,dd,J= 14.3,6.8 Hz,H-7b),2.62(1H,dd,J= 14.3,5.5 Hz,H-7a),2.15(1H,ddd,J= 14.0,6.1,4.2 Hz,H-4b),1.95(1H,ddd,J= 14.0,8.4,6.6 Hz,H-4a);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:84.9(C-1),56.5(C-2),83.8(C-3),38.5(C-4),71.5(C-5),76.3(C-6),40.0(C-7),132.3(C-1′),110.5(C-2′),149.3(C-3′),148.1(C-4′),116.1(C-5′),119.8(C-6′),131.8(C-1′′),114.0(C-2′′),148.7(C-3′′),145.8(C-4′′),116.6(C-5′′),122.9(C-6′′),133.7(C-1′′′),110.7(C-2′′′),149.0(C-3′′′),147.5(C-4′′′),116.0(C-5′′′),119.8(C-6′′′),84.7(C-7′′′),55.5(C-8′′′),179.4(C-9′′′),56.3(3′-OMe),56.2(3′′-OMe),56.4(3′′′-OMe)。以上数据与文献[4]报道基本一致,故鉴定化合物10为amomutsaoko A。

化合物11无色胶状物;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:7.54(1H,dd,J= 8.3,1.8 Hz,H-6′),7.51(1H,d,J= 1.8 Hz,H-2′),6.84(1H,br s,H-5′),6.83(1H,m,H-2′′),6.67(2H,m,H-5′′,6′′),3.80(3H,s,3′-OMe),3.72(3H,s,3′′-OMe),3.00(1H,dd,J= 15.6,5.7 Hz,H-2a),2.84(1H,dd,J= 13.8,6.8 Hz,H-7b),2.75(1H,dd,J = 13.8,7.3 Hz,H-7a),2.21(1H,dd,J= 13.6,6.1 Hz,H-4b),1.89(1H,ddd,J= 13.6,9.2,4.7 Hz,H-4a);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:199.6(C-1),45.5(C-2),75.7(C-3),42.7(C-4),73.4(C-5),85.1(C-6),36.0(C-7),130.7(C-1′),114.0(C-2′),145.7(C-3′),149.0(C-4′),115.8(C-5′),122.6(C-6′),132.0(C-1′′),112.1(C-2′′),148.7(C-3′′),153.4(C-4′′),115.9(C-5′′),125.0(C-6′′),56.2(3′-OMe),56.3(3′′-OMe)。以上数据与文献[17]报道基本一致,故鉴定化合物11为renealtin A。

2.2 活性测试

对以上得到的化合物进行了α-葡萄糖苷酶抑制活性的筛选,以阿卡波糖作为阳性对照(IC50=465±23 μmol/L),化合物10和化合物11显示出明显强于阳性对照的活性,其IC50分别为180±12 μmol/L和94±4 μmol/L,其他化合物显示中等或较弱抑制活性(见表2)。

表2 草果中单体化合物α-葡萄糖苷酶抑制活性

进一步对活性化合物11及阳性对照药物阿卡波糖进行了酶动力学活性测试,发现阿卡波糖的动力学直线汇聚在Y轴,即其Vm不变,Km增大符合竞争性抑制剂的特点,这也符合阿卡波糖与α-葡萄糖苷酶的作用关系,而化合物11的动力学直线汇聚在X轴,说明其Km值相等。而随着11浓度的增加,斜率增大,Vm减小,这些特征与该酶非竞争性抑制剂的作用特征一致,说明化合物11是α-葡萄糖苷酶非竞争性抑制剂,Ki值为261 μmol/L(见图4)。

图4 化合物11与α-葡萄糖苷酶动力学实验结果Fig.4 The kinetic assay of 11 with α-glucosidase注:A、B:化合物11和阿卡波糖的Lineweave-Burk双倒数线形结果;C:斜率与化合物11浓度二次线性结果。Note:A and B.Lineweaver-Burk reciprocal plots of 11 and acarbose;C.The secondary plot of slopes versus the concentration of 11.

3 结论

本研究从中药草果的果实中分离得到11个化合物,其中化合物1为酚类化合物,是作为天然产物首次报道,化合物2、8和9为首次从豆蔻属中分离得到的酚类及脂肪酸类化合物;通过α-葡萄糖苷酶抑制活性测试发现其中两个二苯基庚烷类化合物具有强于上市药物阿卡波糖的活性,前期研究表明草果醇提物具有抑制α-葡萄糖苷酶活性且本研究中其余单体成分并无显著抑制活性,推测该类二苯基庚烷类化合物是草果体外发挥降血糖功效的物质基础之一。α-葡萄糖苷酶抑制剂作为临床治疗2型糖尿病的药物近年来被广泛关注,本研究不仅丰富了中药草果的成分多样性,也有望通过其中单体成分抑制α-葡萄糖苷酶的活性进一步发现中药草果在临床上新的应用途径。