白术内酯Ⅱ逆转M2型巨噬细胞极化调控PDL1表达抑制A549细胞迁移

蒋宗蓥,赵云辉,张云亭,郑 一,王建光,刘羽茜,王艳杰

辽宁中医药大学中西医结合学院,沈阳 110847

肺癌是常见的恶性肿瘤,威胁着人类的健康,是公共卫生面临的一项重大难题。据GLOBOCAN 2020年数据和世界卫生组织《世界人口前景》分析,2022年肺癌仍是我国发生率和死亡率最高的肿瘤[1]。在肿瘤微环境中,发挥免疫效用的巨噬细胞多表达为M2型,多项实验结果显示M2型巨噬细胞促进肿瘤细胞增殖与迁移,并与肿瘤耐药呈正相关性[2,3]。肺癌早期M1型巨噬细胞高表达,而中晚期巨噬细胞更倾向于表达M2型[4]。巨噬细胞具有较强的可塑性,并且M1型巨噬细胞比率与生存率增加呈正相关,这让阻断M2型极化或促进M2型复极为M1型策略具有吸引力,为肿瘤免疫治疗提供了重要研究方向[5]。“培土生金法”在治疗肺癌中取得良好成效,本课题组前期发现四君子汤、参苓白术散等培土生金中药复方可以有效抑制肺癌增殖[6,7]。白术内酯Ⅱ(atractylenolide Ⅱ,AT-Ⅱ)是培土生金中药复方中白术里提取的倍半萜单体,在多种肿瘤中具有抗肿瘤活性[8-10]。AT-Ⅱ可以通过诱导凋亡来阻碍肿瘤进展,但其是否可以通过调控免疫,对肿瘤细胞与巨噬细胞间的相互作用产生影响尚不明确,故本文针对AT-Ⅱ对共培养体系下肺癌细胞的免疫调控进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

THP-1细胞、A549细胞,购自武汉普诺赛生命科技有限公司(CL-0233、CL-0016)。

1.1.2 试剂

胎牛血清(四季青,批号19110502);RPMI-1640培养基(普诺赛,货号PM150110B);MTT试剂(碧云天,货号C0009);PMA(Solarbio,货号P6741);RNase inhibitor(BioTeke,货号RP5602);RIPA裂解液(Solarbio,货号R0010)。

1.2 方法

1.2.1 M2型巨噬细胞诱导

参照课题组前期的实验方法[11],用PMA、IL-4与IL-13将THP-1细胞诱导分化为M2巨噬细胞。待其密度达到90%按1∶2进行传代。

1.2.2 共培养模型建立

利用Transwell小室,模拟体内肿瘤微环境[12],将种有M2型巨噬细胞的小室嵌入含A549细胞的96孔板中共同培养。

1.2.3 MTT实验测定A549细胞活力

根据课题组前期实验摸索发现2.5、5 μmol/L AT-Ⅱ单独作用巨噬细胞与A549细胞48 h对其细胞活力无影响。构建共培养体系,检测2.5、5 μmol/L AT-Ⅱ对共培养条件下肺癌细胞活力的影响。A549细胞消化离心后,重悬计数,按4×103个/孔接种于96孔板,设置五个复孔,待其贴壁。将接种不同浓度AT-Ⅱ孵育的M2型巨噬细胞的小室嵌入96孔板中,共培养48 h。然后更换为含MTT的培养基,在37 ℃下孵育4 h。去上清,加入DMSO,放入酶标仪,读取570 nm处OD值,根据实验组与对照组(control,Con)的OD比值计算细胞存活率:细胞存活率=[(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)]×100%。

1.2.4 Real-time PCR实验检测Arg-1的mRNA表达水平

每组设置三个复孔,0、2.5、5 μmol/LAT-Ⅱ作用后提取M2型巨噬细胞,与裂解液混匀静置后,加入氯仿,震荡15 s后放置于室温下3 min。4 ℃ 10 000 g离心10 min,将得到的透明水相与无水乙醇按2∶1混匀,转入吸附柱离心后,弃废液。加入去蛋白液离心30 s后,用漂洗液清洗。最后向装有吸附柱的离心管中加入不含RNA酶ddH2O,4 ℃ 离心得到总RNA。对所得样本进行浓度测定后进行反转录,即将含有模板RNA、引物、Reaction Buffer、RNase Inhibitor、dNTP Mix、M-MLV反转录酶的反应体系放入PCR仪中。将得到的cDNA模板、上下游引物(Arg-1上游:CATAGGGATTATTGGAGC,Arg-1下游:TCATTAGGGATGTCAGCA;GAPDH上游:GACCTGACCTGCCGTCTAG,GAPDH下游:AGGAGTGGGTGTCGCTGT)、SYBR GREEN与MasterMix放入荧光定量仪进行扩增处理。最后进行数据分析,根据溶解曲线判定扩增数据是否可用,若可用则根据2-△△Ct值来判断表达量。

1.2.5 ELISA实验检测TNF-α和IL-1β含量

取共培养体系中的上清,离心去除沉淀物。按照试剂盒说明书稀释标准品与抗体。在加样前,用洗液洗板以使包被抗体保持最佳活性,按照每孔100 μL进行加样,加入抗体后封膜。室温振荡孵育1.5 h后,弃液,漂洗。再向孔中加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素,封膜孵育30 min后再洗涤6次。最后再加入TMB避光静置20 min后终止反应,放入酶标仪进行检测。将校准的OD值(450 nm的测定值减去570 nm的测定值)带入绘制的标准曲线计算出各组上清中TNF-α、IL-1β炎性因子含量。

1.2.6 Western blot实验检测TLR4、p-p65、NF-κB(p65)、PDL1的蛋白表达水平

提取A549细胞,按照试剂盒指示提取总蛋白,采用BCA法进行蛋白质定量。将稀释的样品进行煮沸变性,制成上样液。将上样液按每孔20 μL注入胶槽中,进行电泳。电泳结束后按照“三明治”法转膜封闭。完成后再将PVDF膜用一抗4 ℃孵育。清洗4次后再将其放入二抗中孵育1 h,清洗后转入暗盒,洒匀发光液进行曝光。记录条带的光密度值,计算目的蛋白与内参的比值,用于后续分析。

1.2.7 划痕实验检测A549细胞迁移能力

铺板前在六孔板底背面画三条平行线,将对数生长的A549细胞接种于6孔板,置于培养箱内培养。待细胞贴壁且融合度达到80%时,用200 μL枪头划出与标记线垂直的细胞划痕,清洗细胞碎片,倒置显微镜下观察记录0 h状态。随后将成功种有M2型巨噬细胞的小室转入6孔板中与A549细胞共培养48 h,48 h后拍照记录。

2 结果

2.1 AT-Ⅱ对A549细胞活力的影响

共培养条件下,与Con组(1.000 ± 0.089)相比,2.5 μmol/L组(0.944 ± 0.094)A549细胞活力未见显著变化(P>0.05),5 μmol/L组(0.744 ± 0.111)细胞活力明显下降,具有统计学差异(P<0.01)(见图1)。该项实验数据表明5 μmol/L AT-Ⅱ对巨噬细胞共培养条件下的肺癌细胞活力具有抑制作用。

图1 AT-Ⅱ对共培养条件下A549细胞活力的影响 Fig.1 Effect of AT-Ⅱ on cell viability of A549 in co-culture注:*P<0.05,**P<0.01,下同。Note:*P<0.05,**P<0.01,the same below.

2.2 AT-Ⅱ对M2型巨噬细胞Arg-1的mRNA表达水平的影响

通过溶解曲线判定扩增基因为单一目的基因Arg-1,具有特异性,数据具有可信性(见图2)。与Con组相比,2.5、5 μmol/L组Arg-1表达明显降低,具有统计学差异(P<0.01)(见图3)。Arg-1为M2型巨噬细胞相关的特异性分子,其含量降低说明AT-Ⅱ可以逆转巨噬细胞M2型极化。

图2 Arg-1、GAPDH溶解曲线Fig.2 Arg-1 and GAPDH melting curve

图3 AT-Ⅱ对M2型巨噬细胞Arg-1的mRNA表达水平的影响 Fig.3 Effect of AT-Ⅱ on mRNA expression of Arg-1 in M2 macrophages

2.3 AT-Ⅱ对上清中TNF-α、IL-1β含量的影响

2.5 μmol/L组与Con组相比,上清中TNF-α与IL-1β含量无明显差异(P>0.05)。5 μmol/L组与Con组相比有增多趋势但未构成显著差异(P>0.05)(见图4)。

图4 AT-Ⅱ对上清中TNF-α、IL-1β含量的影响Fig.4 Effect of AT-Ⅱ on TNF-α,IL-1β content in supernatant

2.4 AT-Ⅱ对A549细胞TLR4、p-p65、NF-κB(p65)、PDL1的蛋白表达水平的影响

通过条带宽度及目的蛋白与内参的灰度比值可以看出AT-Ⅱ明显抑制A549细胞表面TLR4蛋白的表达,显著降低p-p65、NF-κB与PDL1蛋白的表达(P<0.01)(见图5与表1)。

表1 AT-Ⅱ对A549细胞TLR4、p-p65、NF-κB(p65)、PDL1蛋白灰度比值的影响

图5 AT-Ⅱ对A549细胞TLR4、p-p65、NF-κB p65、PDL1蛋白表达的影响Fig.5 Effect of AT-Ⅱ on the expression of TLR4,p-p65,NF-κB p65 and PDL1 in A549 cells

2.5 AT-Ⅱ对A549细胞迁移能力的影响

划痕0 h Con、2.5、5 μmol/L三组原始边缘距离无差异(P>0.05),48 h后与Con组相比,2.5 μmol/L与5 μmol/L组细胞的边缘距离明显增大(P<0.01)(见图6)。

图6 AT-Ⅱ对A549细胞迁移能力的影响Fig.6 Effect of AT-Ⅱ on migration ability of A549 cells

3 讨论与结论

肺癌是癌症致死的头号原因,发病初期病情隐匿,容易错过最佳治疗时机[13]。邪之所凑其气必虚,中医认为癌瘤为标,正虚为本,正虚乃成岩。“培土生金法”是五行相生理论的实践化,是“虚则补其母”的具体化。肺癌虽病位在肺,但课题组前期证明“培土生金法”可以通过调理脾脏达到抑制肺癌进展的效果。同时大量实验结果也表明参苓白术散[14,15]、四君子汤[16,17]、健脾益肺方[18]均可以调补脾胃,从而抑制肺癌生长。白术是上述复方中的共有药物,是补脾益气药的代表,其主要药效成分为白术内酯、苍术酮。苍术酮在加热、炮制后含量会明显下降,因此白术内酯成为白术中药煎剂的主要作用成分。以往药理研究发现白术具有抗肿瘤作用,并且无明显机体毒性。AT-Ⅱ是白术中提取的一种倍半萜单体,已证实对多种肿瘤起到抑制作用。

中华中医药学会指出中医药学与免疫学相结合有益于阐明中医药调节机体免疫的机理,为中医药临床有效性提供依据。2018年诺贝尔得者詹姆斯·艾利森与庶佑提出通过调动自身免疫能力来攻击癌症的全新观念,印证了“扶正治癌”理论。在肿瘤微环境中,巨噬细胞被招募至微环境中活化成肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs),多表达为促瘤M2型[19],高表达Arg-1,产生CCL17、CCL18、CCL22等抗炎因子。本研究通过模拟肿瘤微环境的共培养实验发现AT-Ⅱ降低了巨噬细胞Arg-1的表达与肺癌细胞活力,说明AT-Ⅱ可通过减少M2型极化抑制肺癌细胞的增殖能力。M2型巨噬细胞促进肿瘤进展,而M1型巨噬细胞高浸润被证实可以抑制肿瘤转移,与生存率增加呈正相关[20,21]。巨噬细胞较强的可塑性使重编程或再极化成为调节巨噬细胞功能的有效途径。巨噬细胞极化与临床上多种疾病的发生发展相关,尤其是恶性肿瘤。研究表明TAMs根据局部环境呈现一种或几种表型的暂时性表达[22]。本研究通过ELISA测定上清液中M1型巨噬细胞相关因子TNF-α、IL-1β的含量来推断AT-Ⅱ是否将M2型巨噬细胞转换为M1型巨噬细胞来达到抑制肿瘤细胞增殖的效果。结果显示M1型相关因子TNF-α、IL-1β含量有增多趋势但未构成显著性差异,可能与仍处于M2型向M1型转换过渡期,尚未完全逆转为M1型巨噬细胞有关;巨噬细胞极化不受其所在部位本身影响,而是受到其所在特定微环境的信号作用影响。影响极化的因素包括肿瘤细胞来源的因子、肿瘤微环境、巨噬细胞自分泌因子及稳态失衡因素。临床研究表明炎症是癌症的独立危险因素,SII、NLR、PLR等炎性标志物可用于评估癌症患者预后[23]。炎症是肿瘤进展的驱动因素,NF-κB 信号通路是目前最被认可的炎症通路,参与肿瘤进展[24]。同时研究表明激活的NF-κB通路促进M1型巨噬细胞炎症介质的合成释放[25],本研究WB结果显示AT-Ⅱ抑制A549细胞TLR4/NF-κB通路,故可能导致TNF-α、IL-1β含量无显著增加。同时TLR4/NF-κB通路被证实与免疫抑制分子PDL1也有着密切联系,Larsen课题组的富集结果显示PD-L1通过NF-κB富集到其他标志基因集[26]。IL-1α与IFN-γ联合时具有协同作用,Chen等[27]运用siRNA敲低p65,发现细胞因子联合驱动的PD-L1水平降低。实验表明,在肿瘤微环境中PDL1高表达与肿瘤细胞的迁移能力呈正相关[28],与本研究PDL1蛋白水平表达降低与划痕实验愈合速率变慢的结果相吻合,即AT-Ⅱ通过抑制TLR4/NF-κB通路减少PDL1表达从而降低了A549细胞的迁移能力。

在肿瘤微环境中,TAMs被驯服,多表达为促肿瘤型。靶向TAMs治疗已成为肿瘤治疗的新兴途径。本文通过实验证明AT-Ⅱ可以逆转巨噬细胞促瘤型转换,减少PDL1的表达来抑制肺癌细胞迁移,为临床治疗肺癌提供了新思路。