不同干燥方式对马蓝叶的β-葡萄糖苷酶活性和药效成分的影响

刘丹阳, 周 昊, 颜洋洋, 杨潇然, 商士斌, 王成章

(中国林业科学研究院 林产化学工业研究所;江苏省生物质能源与材料重点实验室;国家林业和草原局林产化学工程重点实验室;林木生物质低碳高效利用国家工程研究中心;江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心, 江苏 南京 210042)

马蓝(Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek.)为爵床科多年生草本植物[1-4],马蓝叶的主要药效成分为靛玉红、靛蓝、吲哚苷等吲哚类生物碱[5-7]。其中吲哚苷(3-羟基吲哚-β-葡糖苷)又叫靛苷[8-9],是靛蓝和靛玉红的前体物质[10],具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎等生物活性;靛玉红具有抗癌活性,能够治疗慢性粒细胞性白血病等恶性肿瘤[11];靛蓝既可用于食品、医药和日用化妆品着色又具有抗氧化、抗菌消炎等作用[12]。β-葡萄糖苷酶是催化糖苷键水解的酶,参与生物体内糖代谢,对维持生物体正常生理功能起着重要作用,也在植物趋毒、防御害虫以及次级代谢等方面具有重要的生物学功能[13-14]。干燥是中药材生产过程中最普遍且关键的加工环节,具有杀菌抑菌、改善外观品质、延长储存期、减少运输质量及便于后续加工等作用[15-16]。目前马蓝产区通常采用自然阴干和晒干等传统方式对马蓝进行干燥处理,但存在规模小、技术落后、过程难控、费时耗力等问题。因此,本研究对比阴干、晒干、真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷冻干燥、热风枪吹干、微波干燥和微波烘干9种干燥方式对马蓝叶外观和内在品质的综合影响,探究干燥过程中的内部生物碱转化机制,以期为马蓝叶干燥加工新技术的引进与推广提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器

新鲜马蓝(Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek.)叶,由贵州小生源有限公司提供,含水量75.80%;靛蓝、靛玉红、吲哚苷、甲醇,均为市售色谱纯;对硝基苯酚、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、碳酸钠、磷酸氢二钠、柠檬酸,均为市售分析纯。

CBM-10A VP Plus型高效液相色谱仪,日本岛津公司;UV-1800型紫外可见分光光度计,上海美谱达有限公司;FD-1C-50+真空冻干机,北京博辰实验仪器有限公司;STXH2000双档温热风枪,苏州百得精密制造有限公司。

1.2 新鲜马蓝叶的干燥处理

称取100 g新鲜马蓝叶,采用阴干、晒干、真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷冻干燥、热风枪吹干、微波干燥和微波烘干等干燥方式进行处理,当马蓝叶含水量小于10%时停止干燥处理,记录干燥时间。

阴干:将新鲜马蓝叶置于阴凉通风避光处,厚 1 cm(单层),定期翻动至全干,干燥总时间240 h,叶片含水9.86%。晒干:将新鲜马蓝叶置于阳光下,厚1 cm摆一层,晚上用自封袋收回密封,防止返潮,定期翻动至叶片全干,干燥总时间70 h,叶片含水9.24%。真空干燥:将新鲜马蓝叶平摊一层于托盘中,置于50 ℃真空烘箱中烘干,干燥总时间8 h,叶片含水7.21%。50 ℃烘干:将新鲜马蓝叶平摊一层于托盘中,置于普通鼓风烘箱50 ℃烘干,定期翻面至叶片全干,干燥总时间5 h,叶片含水6.49%。100 ℃烘干:将新鲜马蓝叶平摊一层于托盘中,置于普通鼓风烘箱50 ℃烘干,定期翻面至叶片全干,干燥总时间40 min,叶片含水5.62%。冷冻干燥:将新鲜马蓝叶平摊一层于托盘中,置于真空冻干机中除水干燥,干燥总时间30 h,叶片含水9.69%。热风枪吹干:将新鲜马蓝叶摊开在桌面,用2 000 W热风枪在适当距离吹并翻动至干燥,干燥总时间10 min,叶片含水6.87%。微波干燥:将新鲜马蓝叶平摊一层于托盘中用微波炉短暂加热后摊凉并反复至完全干燥,干燥总时间3 min,叶片含水6.56%。微波烘干:将新鲜马蓝叶平摊一层于托盘中用微波炉加热1 min后鼓风烘箱50 ℃烘至全干,干燥总时间4 h,叶片含水6.79%。

1.3 马蓝叶干燥物的成分测定

1.3.1吲哚苷成分分析

1.3.1.1标准曲线的绘制 称取5 mg吲哚苷标准品,加入超纯水定容至10 mL,超声波振荡溶解30 min,用0.45 μm微孔滤膜过滤后得到滤液,各取4、 8、 12、 16、 20和24 μL注入液相色谱仪中,重复进样2次,取平均值,并以峰面积(y)和对应的质量浓度(x)绘制标准曲线,得回归方程y=6×107x+286 635(R2=0.999 6),x在40～240 mg/L范围内线性关系良好。

1.3.1.2含量测定 采用高效液相色谱仪对干燥后的马蓝叶中含吲哚苷量进行测定。色谱条件:C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm×5 μm),流动相为甲醇和水(体积比20∶80),流速 1.0 mL/min,检测波长230 nm,柱温20 ℃,进样量 20 μL,测试液质量浓度0.5 g/L(溶于超纯水)。

1.3.2靛蓝、靛玉红成分分析

1.3.2.2含量的测定 采用高效液相色谱仪对干燥后的马蓝叶中靛蓝、靛玉红含量进行测定。色谱条件:C18色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm);流动相为甲醇和水(体积比30∶70),流速1.0 mL/min,检测波长289 nm,柱温20 ℃,进样量20 μL,测试液质量浓度0.5 g/L(溶于N,N-二甲基甲酰胺)。

1.4 β-葡萄糖苷酶酶活的测定

1.4.1对硝基苯酚标准曲线的绘制 以1 mol/L碳酸钠溶液作为溶剂,配成质量浓度分别为1.73、 3.46、 4.33、 5.12、 6.93、 10.39 mg/L的对硝基苯酚标准溶液。以1 mol/L碳酸钠溶液为空白,以对硝基苯酚质量浓度(X)为横坐标,最大吸收峰402 nm处的吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线:A=0.018 7X+0.005 8(R2=0.999 9)。

1.4.2β-葡萄糖苷酶酶活的测定 称取2.5 g剪碎的经干燥处理后的马蓝叶,加入适量预冷的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(由0.2 mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L柠檬酸复配而成,pH值6.0),冰浴上充分研磨成匀浆。将匀浆移入离心管中,4 ℃、 15 000 r/min离心10 min。将上清液移入容量瓶中,用缓冲液(pH值为6.0)定容至25 mL,得粗酶提取液,4 ℃贮存备用。

在试管中加入0.6 mL pH值为6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,0.2 mL对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG,25 mmol/L)和0.2 mL粗酶提取液,将试管置于55 ℃恒温水浴中45 min,反应结束后,向反应体系中加入2.5 mL 1 mol/L碳酸钠溶液终止反应,稀释数倍后用紫外可见分光光度计在波长402 nm处测定酶液的吸光度值。β-葡萄糖苷酶活力国际单位定义:pNPG为底物,在一定的分析条件下,每分钟释放出1 μmol对硝基苯酚所需要的酶量定义为 1 个国际单位 U。样品中的酶活(E,U/g)根据下式计算[14]。

E=(Y×V2×V×N)/(K×V1×m×t)

式中:Y—酶促反应的吸光度;V—酶液的提取体积, mL;V1—反应体系中酶液体积, mL;V2—总反应液体积,mL;K—对硝基苯酚标准曲线的斜率;m—试样质量,g;t—反应时间,min;N—稀释倍数,倍。

2 结果与讨论

2.1 干燥方式对马蓝叶性状的影响

新鲜马蓝叶是绿色,但当叶片破损后会变成蓝色。这是因为马蓝叶中不存在靛蓝[15],但存在由靛蓝的前体吲哚酚和葡萄糖结合而成的吲哚苷,当叶片破损,吲哚苷会被叶绿体中β-葡萄糖苷酶水解生成3-羟基吲哚,而3-羟基吲哚化学性质极不稳定,遇氧迅速反应,除自发氧化生成吲哚醌或靛红外,还会进一步氧化双聚生成靛蓝、靛玉红等物质(图1)。

图1 马蓝叶中生物碱转化过程[17]Fig.1 Alkaloid transformation process in B. cusia[17]

9种干燥方式处理后的马蓝叶见图2。由图可见,马蓝叶性状存在明显差异,相同点在于叶片萎缩、质地干脆,不同点在于真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷冻干燥4种处理方法得到的干叶明显变黑、严重卷曲,而热风枪吹干、微波干燥和微波烘干3种方式处理的干叶仍保留绿色舒展状态,但热风枪干燥过程可能由于过热使叶片局部变黑,阴干叶和晒干叶为黄绿色轻微卷曲状态。

2.2 干燥方式对马蓝叶药效成分的影响

不同干燥方式对马蓝叶中主要药效成分吲哚苷、靛蓝和靛玉红的质量分数影响见表1。由表可知,微波干燥和热风枪吹干所得干叶的吲哚苷质量分数最高(均大于8%),这是因为微波和热风枪处理时瞬间温度可达100 ℃以上,甚至200 ℃,高温处理使β-葡萄糖苷酶几乎完全失活,故叶子中吲哚苷得到保存。先微波加热1 min再50 ℃烘干的马蓝叶中含吲哚苷量为微波干燥叶中的50%左右,说明经过微波处理1 min后叶子中部分吲哚酶活性保存,使叶子中吲哚苷在50 ℃烘干4 h过程中继续酶解;其他干燥方式的吲哚苷质量分数均不大于0.3%。因此,对比未处理、阴干、晒干、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、真空干燥、冷冻干燥等方式,微波处理可以短时高效地制得富含吲哚苷的干燥马蓝叶,使叶中吲哚苷质量分数提高至少25倍以上。

表1 干燥方式对马蓝叶中药用成分及酶活的影响Table 1 The effect of drying methods on the medicinal components and enzyme activities of B.cusia leaves

50 ℃烘干、 100 ℃烘干处理的叶子中靛蓝质量分数最高,在0.68%～0.81%之间,叶片颜色最黑(图2);阴干、真空干燥和冷冻干燥3种处理的叶子中靛蓝质量分数接近,在0.28%～0.34%之间;热风枪和微波处理的叶子中的β-葡萄糖苷酶失活,吲哚苷没有转化为靛蓝或靛玉红,故靛蓝、靛玉红含量最低,可以忽略不计;冷冻干燥、 50 ℃烘干和阴干3种处理的叶子中靛玉红质量分数较高,在0.047%～0.075%之间。因此,50 ℃烘干是制备较高靛蓝和靛玉红含量的干燥方式。

2.3 干燥方式对马蓝叶中β-葡萄糖苷酶活性的影响

不同干燥方式对马蓝叶中β-葡萄糖苷酶活性的影响亦见表1。由表可知,冷冻干燥后的马蓝叶酶活性最高,其次是晒干叶和真空干燥叶,说明低温干燥法对酶活影响最小;热风枪吹干、微波干燥、微波烘干3种方法处理后的马蓝叶中酶活性最低,且酶活小于100 ℃烘干处理的马蓝干叶,这是因为上述3种干燥方法瞬间温度可大于100 ℃。以上结果表明不同干燥处理方式影响马蓝叶中β-葡萄糖苷酶活性。阴干、晒干、真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷冻干燥过程中均发生了由β-葡萄糖苷酶催化的降解反应,干燥过程中叶子逐渐失水变形,导致细胞破碎,吲哚苷和酶接触发生酶促降解反应,吲哚苷含量降低,生成靛蓝或靛玉红。且由于β-葡萄糖苷酶最适温度在40～50 ℃[14],因此,50 ℃烘干制备马蓝干叶可得到高含量的靛蓝和靛玉红。

3 结 论

以马蓝干叶性状、药效成分(吲哚苷、靛蓝和靛玉红)和β-葡萄糖苷酶活性为指标,考察阴干、晒干、真空干燥、 50 ℃烘干、 100 ℃烘干、冷冻干燥、热风枪吹干、微波干燥和微波烘干9种干燥方式对马蓝叶的外观和内在品质的影响。研究结果表明:在50 ℃烘干过程,马蓝叶片过度卷曲且变黑,叶中β-葡萄糖苷酶可以保持较高活性,吲哚苷降解生成较高含量的靛蓝和靛玉红;微波干燥可对叶片进行均匀地传递热量,确保马蓝叶快速升温、均匀失水干燥,有效避免局部温度过高的现象,使β-葡萄糖苷酶高温失活,阻止了干燥过程中酶促反应的发生,减少中间产物生成,可以快速制备得到富含吲哚苷(8.84%)的绿色马蓝叶片。