UPLC-MS/MS法同时测定白酒中氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯

陈 艳，刘 冲，张国宇，张 琴，任 伟，张冰雪

（遵义市产品质量检验检测院，贵州遵义 563000）

白酒作为在我国具有上千年历史传承的世界六大蒸馏酒之一，以其独特的风味和独特的生产工艺，深受广大民众的青睐。白酒酿造工艺源远流长，但在其生产和存储过程中都可能产生一些风险物质，如尿素、甲醇、氰化物及其衍生反应物等[1-4]。

氨基甲酸甲酯（Methy Carbamate，MC，又名尿基烷）及氨基甲酸乙酯（Ehthy Carbamate，EC，又名尿烷），主要由尿素、氰化物与乙醇、甲醇等在发酵和存储过程中产生[5-6]，广泛存在于发酵食品（面包、酸奶、奶酪、酱油、醋）和酒精饮料（葡萄酒、啤酒、白酒等）中[7-12]，具有潜在的毒性和致癌性[13]，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌[14-15]，长期接触EC可能导致神经系统疾病[16]。作为一种潜在致癌物化合物，2007 年被世界卫生组织国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）列为2A 类致癌物[17-18]。白酒中EC 的产生主要来源于两个阶段，发酵阶段主要是乙醇和尿素产生，存储阶段主要由氰化物和尿素产生[19]，且乙醇会加速EC 的形成[20]，通过摄入酒精饮料EC 的致癌性可能较其他途径高[21]。早在1985 年，加拿大就规定了葡萄酒、白兰地和威士忌中EC 的限量值150 μg/L[22]，许多欧美国家参考加拿大的值，对EC的最大允许限量进行相关规定。近年来研究发现大部分酒精饮料及发酵食品中均检出不同浓度的EC，故EC 产生的食品安全风险隐患已成为白酒行业关注的热点问题之一。我国尚未制定EC 的限量标准，但研究发现我国部分蒸馏酒EC 含量已超过加拿大的最大限量值[23]，有必要建立同时测定白酒中MC和EC的高效、快速检测分析方法。

目前针对白酒中MC 和EC 的检测方法有很多，常见的有气相色谱串联质谱法、液相色谱串联质谱法、液相色谱法、液质连用法（选择离子监测）、超高效液相色谱-高分辨质谱法[24-27]，然而大部分都是针对性的检测EC，关于液相色谱串联质谱法检测MC 还未见报道。我国关于酒精饮料中EC 检测标准有SN/T 0285—2012《出口酒中氨基甲酸乙酯残留量检测方法 气相色谱-质谱法》，DBS22/011—2013《食品安全地方标准饮料酒中氨基甲酸乙酯的测定气相色谱-质谱法》，现阶段最常用的强制性检测标准为GB 5009.223—2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》，该标准采用GC-MS 的选择离子监测模式（Selected Ion Monitoring，SIM），其选择离子受干扰程度大，可能会影响检测结果的定性和定量，且该方法样品前处理较为复杂，耗时长，成本较高，不利于开展大批量白酒中MC 和EC 的风险监测。液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）选择性强、灵敏度高、精密度好，具有较好的分离能力和抗基质干扰能力，白酒基质相对较简单，因此可在液相色谱串联质谱上直接进样分析，且尚未有标准和研究报道采用UPLC-MS/MS同时检测白酒中的MC和EC。

鉴于白酒在国内外有巨大的消费群体以及可能由MC 和EC 带来的安全风险，有必要建立同时测定白酒中MC 和EC 的高效、快速检测方法，提高工作效率，缩短检测时间，降低检测成本，为白酒生产企业日常监测以及监管部门监督抽检提供准确可靠高效的技术手段，为制定相应的限量值提供科学依据，为推动白酒行业高质量发展提供保障。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

白酒：抽样及市售。

试剂及耗材：氨基甲酸甲酯标准品（纯度均≥99.8%），上海安谱实验科技股份有限公司；氨基甲酸乙酯标准品（纯度均≥99.9%），坛墨质检科技股份有限公司；甲酸、乙腈、甲酸（质谱纯），德国默克公司；水为实验室自制。

仪器设备：安捷伦1290 InfinityⅡ超高效液相-串联G6470 A 质谱仪，美国Agilent Technologies 公司；Milli-Q 超纯水仪，美国密理博公司；AB265-S型分析天平（感量：0.0001g），瑞士Mettler Toledo 公司；HT-200 多管涡旋混匀仪，上海沪析实业有限公司；Waters Acquity UPLC HSS T3 C18 柱(2.1 mm ×100 mm,1.8 μm)。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取MC、EC 标准物质0.10 g 于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，分别配制浓度10 g/L的标准储备液。取适量标准储备液于同一容量瓶中，用甲醇稀释成质量浓度为10 mg/L 的混合标准中间储备液。临用前，用水溶液稀释浓度为10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L 的系列标准溶液。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 C18 柱(2.1 mm ×100 mm,1.8 μm)，柱温：40 ℃，流速：0.2 mL/min，进样体积：1 μL，流动相A 为0.1 %甲酸水，B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1 UPLC-MS/MS梯度洗脱条件

1.2.3 质谱条件

离子源为带有Agilent 喷射流技术的电喷雾离子源（Agilent electrospray ionization,AJS ESI），干燥气温度：250 ℃；干燥气流量：7 L/min；喷嘴电压：35 psi；鞘气温度：350 ℃；鞘气流量：12 L/min；电喷雾电压为3000 V；采用正离子扫描模式，多反应监测(MRM)模式进行检测。

1.2.4 样品处理

白酒基质相对较简单，LC-MS/MS 技术在增强灵敏度、抗基质干扰方面有较强的优势，因此取适量白酒样品于2 mL进样小瓶中，混匀，直接进样。

1.2.5 结果定性与定量

样品经UPLC-MS/MS 测定得到质谱色谱图，在扣除背景后的样品质谱图中要求试样中不仅待测物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰保留时间一致，所选择的定量离子和定性离子必须同时出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，且两个离子的相对离子丰度比与浓度相当的标准溶液比较，容许偏差应在允许范围内。以定量离子峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，测定样品中待测组分的含量。

2 结果与分析

2.1 不同稀释溶剂的选择

在预实验中选择乙腈作为EC 和MC 系列标准溶液的稀释溶剂，经检测分析，EC 峰形较宽且有分叉，通过调节梯度洗脱比例、流速等因素，均无法完全分离，Waters Acquity UPLC HSS T3 C18 柱为强极性色谱柱，考虑可能为溶剂效应。因此，同时选择超纯水、甲醇、乙腈作为稀释溶剂，检测结果见图1，超纯水和甲醇稀释后EC峰形较好，响应值接近，最终选择超纯水作为稀释溶剂。

图1 不同溶剂稀释后EC的总离子流图

2.2 色谱条件和质谱条件优化

色谱条件优化过程中，在流动相水相中加入0.1%甲酸作为质子供体，可提高离子的响应，改善峰型。优化质谱条件时，选择浓度为100 μg/L的单标溶液，分别对MC及EC进行3种离子化形式的一级扫描[M+H]、[M+NH4]、[M+Na]和二级质谱扫描。首先选择Q1 MS1 全扫描模式，进行母离子扫描获得在对应模式下的质荷比，利用Q3 MS2 碎片离子扫描模式寻找二级质谱碎片离子；然后在MRM 模式下，碰撞能（collision energy，CE）以5 V为间隔，从15 V 调至50 V，优化碰撞能，观察被测组分出峰的时间范围，确保图谱由12～15 个采集点构成，选择最佳的去簇电压（declustering potential，DP）和碰撞能量，以达到最大响应值；最后选取响应最高的子离子作为定量离子，响应次之的作为辅助定性离子。在优化过程中，发现[M+NH4]能找到母离子，但在Q3 MS2 模式下没有产生碎片离子；[M+Na]母离子响应值高，碎片离子个数也多，但在MRM 模式下只有一个离子通道出峰，最终选择[M+H]离子化形式下寻找母离子和碎片离子，并优化质谱参数，质谱参数见表2，MRM 模式下质谱图和色谱图见图2。

图2 MC和EC的色谱图与质谱图

表2 MC和EC质谱参数

2.3 方法学考察

2.3.1 线性方程、检出限和定量限

准确吸取MC和EC标准储备液适量，加水稀释配制成浓度为10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L 的系列标准混合溶液，以峰面积为纵坐标（y），浓度为横坐标（x），建立标准曲线，结果见表3。结果提示MC 和EC 均在10～200 μg/L 浓度范围内具有良好的线性关系，其相关系数R2均大于0.99，以信噪比3（S/N=3）和信噪比10（S/N=10）为方法检出限（LOD）和定量限（LOQ），方法灵敏度高，能满足相关样品的定量检测需要。

表3 MC和EC的线性方程

2.3.2 加标回收率和精密度

取白酒样品0.5 mL，分别添加3 个不同水平MC 和EC 的混合标准溶液0.5 mL（3 个水平质量浓度分别为为20 μg/L、40 μg/L、100 μg/L）,混匀，每个水平连续测定6 次，进行加标回收率和精密度试验，并计算相应的加标回收率和相对标准偏差（relative standard deviation,RSD），结果见表4。由表4可知，2 种化合物的平均回收率为76.29 %～98.81 %，精密度试验的相对标准偏差（RSD）为2.81 %～5.05 %，结果表明该方法回收率高，精密度能达到分析测定的要求。

表4 白酒中MC和EC的加标回收率及精密度试验结果

2.3.3 白酒样品中MC和EC的测定

应用本研究前期所建立的方法对3 种不同类型酒样（共15 批次）中MC 及EC 进行检测，检测结果如表5 所示。结果表明，15 批次酒样中均未检出MC，15 批次EC 检出率为100 %，酱香型基酒5 批次检出范围为150.58～189.29 μg/L，平均值为167.61 μg/L；酱香型成品酒5 批次检出范围为87.03～120.63 μg/L，平均值为101.8 μg/L；小作坊酒5 批次检出范围值为15.63～26.75 μg/L，平均值为21.62 μg/L，3 种不同类型白酒中EC 的含量差异具有统计学意义。

表5 白酒样品中MC和EC的测检测结果 (μg/L)

3 结论

本研究建立了同时检测白酒中MC 和EC 的UPLC-MS/MS 分析方法。通过对稀释溶剂的选择，超高效液相色谱和质谱条件的优化，MC 和EC 峰型良好,且能在较短时间7 min 内完成出峰。方法学结果表明，MC 和EC 在10～200 μg/L 浓度范围内，线性关系良好，相关系数R2分别为0.9994和0.9996，两者定量限（LOQ）分别为8.5 μg/L 和7.6 μg/L，MC 加标回收率为76.29 %～85.73 %，RSD 为3.8 %～5.5 %，EC 加标回收率为87.73 %～98.81 %，RSD 为2.8 %～3.0 %。该方法简便、高效、准确、快速、灵敏度高，可为白酒中MC 和EC 的分析和监管提供方法参考。

对15 批次样品进行检测分析，检测结果表明，15 批次酒样中均未检出MC，15 批次EC 检出率为100 %，表明白酒样品中EC 的残留是普遍存在的[28-29]。小作坊玉米、高粱酒EC 平均含量最低，为21.41 μg/L；酱香型成品酒EC 平均含量次之，为101.8 μg/L；酱香型基酒EC 平均含量最高，为167.21 μg/L。小作坊酒主要以玉米和高粱为原料，生产周期短、发酵温度低、发酵时间短，故而生成的EC 量较少。酱香型基酒经过勾兑后，酱香型成品酒中EC 的平均含量显著降低，该结果均与文献报道一致[19]。不同类型白酒样品中的EC 值存在显著性差异，进一步证实了白酒的生产工艺和储存条件对EC含量的影响。

随着广大消费者群体食品安全意识的不断提升，推动了白酒产业安全高质量发展，白酒中EC存在的安全隐患不容忽视，MC 也为潜在的致癌物，因此，建议相关监管部门完善白酒及其他酒精性饮料中EC、MC的风险监测体系。