浓香型大曲培菌期主要微生物变化及挥发性风味物质合成影响因素研究

刘 能，何朝玖，陈 杰，高 杰，罗惠波，3，黄 丹，3，李子健*

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川自贡 643000；2.宜宾南溪酒业有限公司，四川宜宾 644000；3.酿酒生物技术及应用重点实验室，四川自贡 643000）

浓香型大曲为白酒酿造提供丰富的酶系、菌系和物系。大曲中曲霉、根霉、芽孢杆菌、乳酸杆菌、Wickerhamomyces和Saccharomycoposis等[1-2]微生物产生的糖化酶、液化酶和蛋白酶可以将淀粉、蛋白质等大分子物质降解，并进一步将其转化为醇类、酯类、酸类、吡嗪类等挥发性风味物质，从而赋予白酒丰富的香气[3]。制曲过程中微生物与微生物、微生物与环境相互作用，最终形成大曲微生物菌群，并参与白酒的后续酿造[4]。已有研究发现大曲中细菌和真菌在酒醅中的比例分别为81.5 %和79.2 %[5]。大曲微生物的多样性与含量对浓香型白酒的品质形成至关重要[6]。

制曲过程中微生物的演替与环境因子包括温度、酸度、湿度等密切相关[7]。Wu 等[8]发现大曲微生物群落中优势微生物beta 多样性的变化与温度显著相关。在发酵过程中，环境过滤(即环境对某些微生物群落的定殖或存活具有适应性)是一个重要的选择过程[9]。乳酸菌和酵母菌可以在大曲发酵初期低温条件下保持优势地位，可能是由于其生存对酸、醇和抗生素生产的优势以及对资源和生态位的竞争[10]。随着发酵温度的升高芽孢杆菌在发酵过程中比山球菌更具竞争力,分泌出淀粉酶和蛋白酶将淀粉和蛋白质转化为葡萄糖和氨基酸，促进风味化合物前体的形成[11]。这是基于物种热耐受特性的温度驱动选择，在形成微生物结构和代谢方面发挥着至关重要的作用[12]。环境因素对发酵微生物群的生长代谢和演替有着强烈的影响，目前许多研究表明微生物群落的生长代谢和演替发生的驱动因素为酸度、水分和温度等[13]。

培菌期作为大曲主发酵期，是影响大曲质量的关键环节，此时大曲微生物变化最为显著。Zheng等[14]分析制曲过程中微生物多样性演变与温度、pH值、酸度、水分等环境因子的相关性，发现温度、pH值与发酵中间阶段微生物群落结构呈现正相关，水分与发酵结束阶段微生物群落结构呈现正相关。有研究表明温度因素通过调控大曲发酵前期微生物群落的演替规律而影响成品曲中微生物群落的组成[15-17]。制曲过程中温度、湿度、水分等导致大曲微生物多样性发生变化，代谢产生不同的物质，可视为因环境因子胁迫而引起的微生物生态系统发生变化、产生相应的反应和功能[18]。目前用高通量测序技术研究制曲过程中微生物演替取得了很多成果，Yang 等[19]通过扩增子测序发现浓香型大曲升温发酵阶段微生物数量最为丰富，主要由毕赤酵母属、曲霉菌、根霉属、片球菌属和乳酸杆菌组成。高通量测序技术的广泛使用克服了可培养研究微生物的局限性，但由于大多数只能提供微生物属水平的信息，针对已报道的大曲优势微生物可利用可培养的方法对其增殖进行具体表征，有助于明确不同发酵环境条件下大曲发酵过程中微生物的生长代谢规律，为控制大曲制备工艺以及提高品质提供重要理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

大曲样品的采集：分别对浓香型大曲培菌期曲房4 个不同位置培菌期（第0 天、1 天、2 天、3 天、4天、5 天、6 天、7 天、8 天、9 天，不同位置大曲的采集时间略有差异）大曲进行采集，共计26 个样品。样品采集后，将大曲粉碎均匀，每份称取约100 g 密封于无菌袋中-4 ℃保藏,用于菌落的计数；称取20.00 g 存入密封无菌袋-80 ℃保藏，用于挥发性风味物质的测定。

试剂及耗材：PDA 琼脂、YPD 琼脂、氯霉素、PD琼脂、无水乙醇、碳酸钙、MRS 琼脂、牛肉膏蛋白胨琼脂、氯化钠。

仪器设备：BXM-75VD 立式蒸汽压力灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ZHJHC1118C 超净工作台，上海智城分析仪器制造有限公司；BGZ-140 电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；JXBS-J001-TH-RS 高精度环境传感器，威海精讯畅通电子科技有限公司；5975B-7890A 气相色谱-质谱联用仪，安捷伦科技（中国）有限公司；50 μm/30 μmVB/CAR on PDMS萃取头，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大曲水分含量及环境温湿度测定

采用直接干燥法测定大曲样品的水分含量[20]。利用在线环境检测系统传感器实时监测大曲各采样点的温度、湿度。

1.2.2 大曲中主要微生物菌落总数的测定

采用稀释平板计数法，酵母菌采用YPD 琼脂培养基计数[21]；醋酸菌采用醋酸选择培养基计数[22]；乳酸菌采用MRS 培养基计数[23]；霉菌采用PDA 培养基计数[24]；芽孢杆菌采用牛肉膏蛋白胨培养基计数[25]。

1.2.3 大曲挥发性风味物质的测定

取3.00 g 大曲样品于20 mL 的顶空瓶中，加入2.00 g氯化钠，20 μL乙酸戊酯作为内标物，50 ℃平衡5 min，插入50 μm/30 μmVB/CAR on PDMS 萃取头，萃取50 min，解吸4 min[26]。

气相色谱条件：毛细管色谱柱DB-WAX，规格为（30 m×320 μm×0.25 μm）；进样口温度250 ℃，未分流模式；程序升温：40 ℃保持3 min，5 ℃/min 到180 ℃，最后以2.5 ℃/min 的速度升到230 ℃，保持10 min，共计50 min；载气：高纯度氦气，流速为1 mL/min。

质谱条件：电子轰击电离(EI)离子源，电子能量70 eV，发射电流200 A，电压350 V，离子源温度200%，接口温度250 ℃，扫描质量范围33～450 u，扫描范围20～500 u。

1.2.4 数据分析

采用Microsoft Office Excel 2016对实验数据进行整理和运算，同时采用SPSS 25.0 统计软件进行统计分析[27]。利用R 语言计算挥发性风味物质间的Spearman 相关性系数，使用Cytoscape3.7.1 进行相关性网络可视化分析。采用皮尔逊相关分析(Pearson correlation)检验4 种不同发酵条件下大曲中酵母菌、醋酸菌、乳酸菌、霉菌和芽孢杆菌的数量变化与挥发性风味成分合成之间的相关性。本实验设定统计显著性水平为P=0.05，极其显著性水平设定为P=0.01。

2 结果与分析

2.1 培菌期环境温湿度及大曲水分变化

曲房不同位置大曲培菌期发酵过程中环境温湿度变化如图1a 所示，发酵过程中温度整体呈现先快速上升后缓慢上升的态势，不同位置的大曲升温速率具有一定的差异，第8 天或第9 天时分别到达了不同的顶温，依次为60 ℃、60 ℃、55 ℃、55 ℃左右。生产过程中主要通过开关门窗调节温湿度，随着发酵的进行，培菌期结束时湿度下降至40 %左右。图1b 为不同位置发酵过程中大曲水分含量的变化，大曲的含水量是逐渐下降的，由于发酵温度的升高和微生物活性的增加会促进水分的蒸发[28]。但是曲房中不同位置大曲所处的发酵环境不同会影响大曲微生物的生长代谢对水分的利用和蒸发，同时不同的温度对水分的蒸发也有具有一定的影响，所以不同位置大曲的水分含量具有一定的差异。培菌期结束时升温速率较快、顶温达到60 ℃左右的大曲中含水量最高，稳定在28%左右；升温速率较慢、顶温为55 ℃左右大曲的水分含量比较低，稳定在24 %左右。大曲水分的挥发主要靠霉菌菌丝的内插而引出[29]，毛霉菌门和放线菌门是大曲中产生菌丝的主要微生物，热放线菌的最佳生长温度为50～55 ℃，缓慢的升温速率和适宜的顶温可能促进了热放线菌的生长。热放线菌的菌丝使大曲的结构松弛，促进了大曲水分的蒸发[13]。

图1 大曲发酵过程中环境温湿度变化（a）和水分含量变化（b）

2.2 不同条件下培菌期大曲主要微生物的变化

培菌期不同发酵条件下大曲中酵母菌数量变化如图2a 所示，酵母菌数量变化均为先上升后下降，最终稳定在一个较低的水平，其峰值都出现在第1 天；醋酸菌数量变化如图2b 所示，大曲中的醋酸菌数量均为先上升后下降，处于升温速率较慢、降湿速率较快发酵条件下的大曲中醋酸菌的繁殖速度和达到的峰值高于处于升温速率较快、降湿速率较慢发酵条件下的大曲中的醋酸菌；乳酸菌在不同发酵条件下的数量变化如图2c 所示，乳酸菌数量变化趋势跟醋酸菌十分相似，均为上升后下降，最终趋于消失；霉菌数量的变化如图2d 所示：不同发酵条件下霉菌的数量整体上呈现上升的趋势，期间出现不断的波动，峰值是非常接近的；芽孢杆菌数量变化如图2e 所示，不同发酵条件下芽孢杆菌的数量整体呈现先上升后下降，其中处于升温速率较慢、降湿速率较快发酵条件下大曲中的芽孢杆菌数量处于不断的波动当中。

图2 不同条件下培菌期大曲主要微生物的变化

2.3 理化因子对大曲主要微生物的影响

采用基于Spearman 系数的相关性网络图分析大曲中主要微生物与理化因子的相关性。结果如图3 所示，酵母菌与湿度、水分呈正相关（p＜0.05）；醋酸菌与温度呈负相关（p＜0.05），与湿度呈正相关（p＜0.05）；乳酸菌与温度呈负相关（p＜0.05），与湿度和水分呈正相关（p＜0.05）；霉菌与温度呈正相关（p＜0.05），与湿度呈负相关（p＜0.05）；芽孢杆菌与温度、湿度和水分没有呈现出显著的相关性（P＞0.05）。

图3 大曲中主要微生物与理化因子的网络分析（r＞0.6，p＜0.05）

2.4 培菌期大曲挥发性风味物质的合成规律

风味Heatmap 图可以直观的反应培菌期不同发酵条件下大曲发酵过程中挥发性风味物质的变化和差异，如图4 所示，对处于不同发酵条件下的大曲挥发性风味物质进行了聚类分析，大曲微生物合成的挥发性风味物质主要有醇类、酸类、醛类以及酯类物质，主要包括乙醇、乙酸、苯甲醛以及乙酸乙酯、棕榈酸乙酯，有的还产生少量的呋喃类、吡嗪类物质等。不同发酵条件下大曲中醇类物质的变化较为相似，随着发酵时间的延长醇类物质含量多为先增加后减少，达到峰值的时间略有差异；大曲升温速率、降湿速率以及水分含量差异会导致酸类物质不同的变化规律；醛类物质含量较低，变化较为一致；酯类物质作为白酒中主要的呈香呈味物质，种类相较于醇类和酸类物质更为丰富，随着发酵时间的延长，酯类物质的种类逐渐增多，不同发酵条件下大曲中所含酯类物质变化是不同的。

图4 大曲挥发性风味物质热图

2.5 培菌期大曲发酵过程中挥发性风味物质网络的构建

为了研究挥发性风味物质之间的伴随关系，构建了大曲挥发性风味物质的共现网络，结果如图5所示，该网络共存在26 个节点，79 条边，模块化为0.686，其中正相关占100%，负相关占0%，说明风味物质之间几乎是以协同的方式相互作用。网络中的模块是指内部紧密连接，但与外部连接较少的节点集合，所以它们之间的相关性更强。基于模块划分和模块计算，整个网络被分为5 个模块，模块0、模块1 和模块2 是三个最大的模块，分别占比24.14 %、31.03 %和27.59 %。模块0 中包括7 个节点，有1 种醇类、3 种醛类、2 种酯类、1 种呋喃类；模块1 中包括9 个节点，有8 种酯类、1 种醇类；模块2中包括8 个节点，有3 种醇类、5 种酯类。酯类和醇类几乎全部占据了模块中的节点，模块中的大部分高级醇能为白酒提供特殊风味，酯类物质能赋予了白酒重要的主体风味，它们之间呈显著的正相关，在模块内紧密相连，说明这些物质在合成上可能具有重要的伴随关系。为进一步研究共现网络中节点的作用及贡献，计算了网络中节点的拓扑性质。介数中心性最高的节点为关键节点[30]。异丁醇、棕榈酸乙酯、乙酸乙酯、油酸乙酯、十四烷酸乙酯和乙酸丁酯被定义为关键风味物质。它们对挥发性风味物质相互作用的传递及网络的稳定性起重要作用[31]，对挥发性风味网络中的信息流影响程度最大。

图5 大曲挥发性风味共现网络（r＞0.6，p＜0.05）

2.6 大曲主要微生物变化与挥发性风味物质合成的相关性

利用Pearson 相关系数对浓香型大曲控制发酵过程中培菌期主要微生物变化及挥发性风味物质合成进行相关性分析，Pearson 相关性分析表明（表1），处于升温速率较慢、湿度下降速率较快、水分含量较低发酵条件下的大曲霉菌与醇类物质的合成具有极其显著的正相关性；处于升温速率较快，降湿速率较慢且含水量较高发酵条件下的大曲霉菌与酸类物质的合成具有显著的相关性；在升温速率较快、降湿速率快且含水量较低发酵条件下的大曲霉菌与酸类物质的合成具有极其显著的相关性；在升温速率较快、降湿速率较慢水分含量较高和升温速率较快、降湿速率较快水分含量较低发酵条件下的大曲霉菌与醛类物质的合成具有显著的负相关性；大曲中的酵母菌、醋酸菌和乳酸菌在升温速率较快、湿度下降速率较慢水分含量较高的发酵环境条件下与酯类物质的合成具有显著的正相关性；处于升温速率较快、降湿速率较快水分含量较低发酵条件下的大曲霉菌与酯类物质的合成具有显著的正相关性；其余微生物数量变化与大曲中挥发性风味物质的合成均无显著的相关性。

表1 浓香型大曲主要微生物与挥发性风味物质合成的Pearson相关性分析

3 结论

本研究以浓香型大曲为原料，利用可培养的方法对浓香型大曲培菌期发酵过程中的主要微生物菌落进行计数，研究结果表明：酵母菌、醋酸菌、乳酸菌的数量随着发酵时间的延长均呈现先上升后下降的趋势，在培菌期后期只有少量存活；霉菌以及芽孢杆菌数量随着发酵时间的延长出现较大幅度的波动，但在培菌期后期仍有大量菌体存活。基于Spearman 相关性系数分析了浓香型大曲培菌期大曲主要微生物与理化因子的相关性，研究结果表明：酵母菌与湿度、水分呈正相关（p＜0.05）；醋酸菌与温度呈负相关（p＜0.05），与湿度呈正相关（p＜0.05）；乳酸菌与温度呈负相关（p＜0.05），与湿度和水分呈正相关（p＜0.05）；霉菌与温度呈正相关（p＜0.05），与湿度呈负相关（p＜0.05）；芽孢杆菌与温度、湿度和水分没有呈现出显著的相关性（P＞0.05）。培菌期大曲挥发性风味物质主要以醇类、酸类、酯类物质为主，同时还产生呋喃类、吡嗪类、酮类以及醛类物质，不同的升温速率、降湿速率以及水分含量会影响各类物质的变化规律；挥发性风味物质之间几乎是以协同的方式相互作用，具有一定的伴随关系。霉菌与酸类物质以及酯类物质的合成具有显著的正相关性，与醛类物质的合成具有显著的负相关性；酵母菌、醋酸菌和乳酸菌与酯类物质的合成具有显著的正相关性。