响应面法优化蓝莓果渣白兰地酿造工艺的研究

何 欢，汪绪珍，陈绍依，刘鸿安，周鸿翔*

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州茅台（集团）生态农业产业发展有限公司，贵州贵阳 550025）

蓝莓(Vaccinium uliginosumL.)，杜鹃花科越橘属植物，外观呈蓝紫色，果实小，常有一层白色果粉包裹。蓝莓果实均重0.5～2.5 g，酸甜可口，不仅可以鲜食，也可以加工成果汁、果酒等其他产品[1]。蓝莓果实除含有丰富的糖、氨基酸、有机酸、维生素和矿物质外，还富含多种功能性成分，抗氧化能力比一般的水果强，具有较高的营养和药用价值，是人类五大健康食品之一，也是“世界第三代水果”[2-3]。蓝莓种植面积逐年增加，产生了果汁、果酒等衍生加工产业[4]，企业加工时会产生大量果渣，如果能对果渣进行合理再利用，不仅可以节约资源，还可避免环境污染[5-6]。本研究以蓝莓果渣为原料研究蓝莓果渣白兰地酿造工艺，内容包括菌种的选择、接种量、不同初始糖含量、发酵温度，比较蓝莓果渣白兰地的理化指标、感官评价，确定蓝莓果渣白兰地的最佳生产工艺，为蓝莓果渣白兰地的酿造提供可行性的生产技术方案，利用蓝莓果渣生产白兰地不仅是一种经济产品，还解决了蓝莓果渣剩余问题，丰富了国内白兰地市场[7]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 原料与菌株

蓝莓果渣、浓缩苹果汁，贵州茅台（集团）生态农业产业发展有限公司；安琪酵母、F33 酵母，市售；异常维克汉姆酵母K-008，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室鉴定保藏；汉逊德巴利酵母，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室鉴定保藏。

1.1.2 试剂

氢氧化钠，重庆川东化工有限公司；酒石酸钾钠，成都金山化学试剂有限公司；葡萄糖，天津永大化学试剂有限公司；3,5-二硝基水杨酸，国药集团化学试剂有限公司；结晶酚，成都金山化学试剂有限公司；亚硫酸氢钠，成都金山化学试剂有限公司；硫酸标准滴定液，广州和为医药科技有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器与设备BSA124S-CW 电子天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；1000 mL 全玻璃蒸馏器，杭州旌斐仪器科技有限公司；酒精计，杭州旌斐仪器科技有限公司；HH-21-6 电热恒温水浴锅，上海助蓝仪器科技有限公司；SW-CJ-1FD 超洁净工作台，海博迅实业有限公司医疗设备厂；SPX-250B-Z 生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；YXQ-75S11 立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ZQPL-200立式全温震荡培养箱，天津菜玻特瑞仪器设备有限公司；500 mL、1000 mL数显电热套，杭州旌斐仪器科技有限公司；BCD-640WAGM冰箱，青岛海尔股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蓝莓果渣白兰地的加工工艺流程及操作要点

原料→调配(加糖、加水)→接种酵母→发酵→原料酒→蒸馏→原白兰地

操作要点：

接种：异常威克汉姆酵母K-008、汉逊德巴利酵母活化，将装有菌株的-80 ℃甘油管划线于YPD固体平板上，30 ℃恒温培养48 h 后，将平板上的单菌落挑至100 mL 灭菌的麦芽汁培养基中，30 ℃下120 r/min 培养48 h，使培养基中细胞数达到1×108CFU/mL，备于接种。安琪酵母、F33 酵母活化，称取适量的活性干酵母，加入含糖5 %的无菌溶液，混匀，于35 ℃水浴锅中保温20～30 min，直至产生大量泡沫[8]。

发酵：在蓝莓果渣中添加浓缩苹果汁和水进行发酵液调配，采用1 L 三角瓶作为发酵容器，水封阀密封，放入恒温生化培养箱进行发酵[9]。

发酵液的蒸馏：使用1000 mL电热套及1000 mL全玻璃蒸馏器进行蒸馏，蒸馏时的温度控制在90 ℃±2 ℃，只收集45%vol以上的酒精[10-11]。

1.2.2 不同酵母菌株对蓝莓果渣白兰地的影响

取一定量的蓝莓果渣，加水及浓缩苹果汁，调整发酵液初始糖含量为216 mg/mL。分别按照0.3 g/L 接种量添加活化好的F33、安琪、K-008、汉逊德巴利酵母，摇匀，28 ℃恒温主发酵，酒精发酵结束后，测定发酵液的各项理化指标，使用全玻璃蒸馏器蒸馏出原白兰地，综合比较不同酵母酿造蓝莓果渣白兰地的出酒率、感官评分，确定酿造蓝莓果渣白兰地的最佳酵母。

1.2.3 蓝莓果渣白兰地酿造工艺优化的单因素试验

在筛选出最佳酵母的基础上，设置酵母接种量（0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L），发酵温度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃），初始加糖量（180 mg/mL、198 mg/mL、216 mg/mL、236 mg/mL、252 mg/mL），测定原白兰地的出酒率并进行感官评分。以出酒率、感官评分为评价指标考察初始含糖量、接种量、发酵温度3因素对蓝莓果渣白兰地的影响。

1.2.4 响应面法优化蓝莓酒酿造工艺

在单因素试验基础上，选取显著因素的最优试验范围，以蓝莓果渣白兰地感官评分为优化指标，对初始加糖量、接种量、发酵温度3 个影响因素利用Design-Expert 8.0.6 软件设计模型开展响应面分析，获取最适发酵工艺参数。响应面模型因素与水平设计见表1。

表1 因素水平设计表

1.2.5 分析检测

酒精度、总酸按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[25]中的方法进行测定；还原糖测定，3,5-二硝基水杨酸比色法[12]。

蓝莓果渣白兰地出酒率计算公式如下[13]：

原料出酒精率(mL/kg)=(初蒸馏液酒精度(%vol)×初蒸馏收集液体积(mL))/原料使用量(kg)

蓝莓果渣白兰地感官评价参照GB/T 11856—2008《白兰地》[14]中的方法进行，男女各10名具有果酒品评经验的人员对蓝莓果渣白兰地的色泽、香气、滋味、典型性进行评分，结果采用均值。感官评分表见表2。

表2 蓝莓果渣白兰地感官评分标准

1.2.6 数据处理

使用Excel 2016、SPSS19.0 进行数据处理，采用Origin9.0 进行绘图，使用Design Expert 8.0.6 软件绘制回归模型及响应面分析图。

2 结果与分析

2.1 不同酵母菌株对蓝莓果渣白兰地的影响

2.1.1 不同酵母的发酵性能

观察并记录4 种酵母发酵时的剧烈程度，发酵结束时测定蓝莓果渣白兰地原料酒的酒精度、残糖、总酸，结果见表3。

表3 不同酵母发酵性能比较

一般来说选择起酵时间短、发酵平稳、发酵结束时残糖低、产酒率高的酵母作为蓝莓果渣白兰地原料酒的发酵菌种[15]。在初始糖度一致的条件下，发酵结束时的残糖越低，说明酵母菌转化还原糖能力越强。比较发酵液残糖、酒精度，4 种酵母存在显著性差异（α=0.05），F33 发酵样品的残糖最低且酒精度最高，显著优于其他3种酵母。

2.1.2 不同酵母对蓝莓果渣白兰地的影响

图1 不同菌种对蓝莓果渣白兰地的影响

不同菌种发酵蓝莓果渣白兰地出酒率从高到低依次是F33、安琪、K-008、汉逊德巴利酵母，蓝莓果渣白兰地感官评分从高到低依次是F33、K-008、安琪、汉逊德巴利酵母。综合发酵性能、产酒率、风味影响，F33 最合适作为蓝莓果渣白兰地的发酵菌种。

2.2 初始加糖量对蓝莓果渣白兰地的影响

由图2 可知，蓝莓果渣白兰地出酒率随初始加糖量的增加逐渐升高，可能是随着加糖量的增多，可用于发酵的糖的总量增加，发酵蒸馏后得到的白兰地酒液也就越多[16]。感官评分随初始加糖量的增加先升后降，初始加糖量为180 mg/mL和198 mg/mL 时发酵速度较快且发酵提前结束，糖大部分转化为酒精，但发酵过程中产生香气成分等物质的基质不足，造成酒体风味寡淡；糖含量合适时，发酵液中酵母生长正常，代谢正常，使发酵过程平稳进行；初始加糖量为236 mg/mL、252 mg/mL 时能得到较高的出酒率，但初始加糖量过高会使残糖增加，发酵液的渗透压增大，抑制酵母菌的生长繁殖，延长了酵母菌的生长适应期，增加了杂菌污染的风险，不利于香气物质积累[17]。从感官评价这一指标看，初始糖含量为216 mg/mL 时的感官评分最高，初始加糖量太高意味着调整糖度时所添加的浓缩苹果汁增多，蓝莓果香、口感会受到影响。综上，蓝莓果渣白兰地发酵的初始加糖量应该选择216 mg/mL。

图2 不同初始加糖量对蓝莓果渣白兰地的影响

2.3 接种量对蓝莓果渣白兰地的影响

果酒发酵是在酵母作用下，经EMP 途径酵解生成丙酮酸，在无氧条件下经脱羧酶脱羧转化为乙醛，再由乙醛脱氢酶还原成乙醇的过程，酵母接种量影响发酵速度[18]。如图3 所示，出酒率总体上随着酵母接种量的增加缓慢上升，感官评分先升高后下降。接种量为0.1 g/L时无法保证酒精积累，发酵不完全并且残糖量过高，发酵周期较长，杂菌污染的可能性增大[19]；随着酵母菌含量增加，其生长繁殖速度加快，无氧呼吸产生的酒精增多，出酒率升高，消耗的糖也增多[20]；当酵母接种量过多时，发酵液中的酵母菌浓度高，代谢副产物逐渐增多，酒香逐渐增加，但“酵母味”也相应增加，蓝莓原有的果香味逐渐被掩盖。综上，蓝莓果渣白兰地的最佳酵母接种量为0.3 g/L。

图3 接种量对蓝莓果渣白兰地的影响

2.4 温度对蓝莓果渣白兰地的影响

温度通过影响酶的活性、细胞质膜的流动性以及物质的溶解度等影响酵母菌的正常生长[21]。由图4 分析可知，出酒率先升后降，低温时酵母菌代谢能力不强，糖分利用不完全，出酒率低；温度升高至26 ℃、28 ℃时，酶活性增强，消耗糖分增多，出酒率升高；当温度升高到30 ℃时，温度过高使得酵母过早的老化，代谢能力下降，导致出酒率降低[22]。随发酵温度的升高，感官评分呈现下降的趋势；相同接种量条件下，温度升高，酒精的发酵变强，发酵体系可能产生内热影响酵母的生长繁殖，不利于发酵过程中香气物质的积累，导致蓝莓果香味不强，并伴随少量的杂味[23-24]。因此，蓝莓果渣白兰地发酵温度选择28 ℃为宜。

图4 不同温度对蓝莓果渣白兰地的影响

2.5 响应面法优化蓝莓果渣白兰地发酵工艺

2.5.1 Box-Behnken响应面实验结果

在单因素试验基础上，选择酵母接种量（g/L）、初始加糖量（mg/mL）及发酵温度（℃）3个因素进行响应面优化试验，以蓝莓果渣白兰地感官品评得分为响应指标，采用Design Expert 8.0.6 设计三因素三水平的Box-Behnken 试验。Box-Behnken 试验设计与结果如表4所示。

表4 响应面实验设计结果

2.5.2 响应面模型建立及方差分析

Design-Expert 8.0.6 分析软件对表4 的实验数据和结果进行了多元回归拟合分析，得到了蓝莓果渣白兰地感官品评(Y)与编码自变量酵母接种量(A)、初始加糖量(B)及发酵温度(C)的二次多项回归数学模型：

感官评分（Y）=+78.02+0.74A+0.49B-0.92C+1.90AB+2.68AC+1.83BC-5.38A2-6.73B2-5.01C2

由表5 可知，相关系数R2=0.9955、R2adj=0.9896，模型P 值＜0.01（模型极显著），失拟项P 值为0.5098＞0.05（不显著），证明该回归模型方程拟合度较好，误差小，可行性高，能用于本试验的预测分析。一次项A、B、C 显著（P＜0.05），交互项AC极显著（P＜0.01）,AB、BC 显著（P＜0.05），二次项A2、B2、C2极显著（P＜0.01），由F 值可知，对感官评分影响的排序为：发酵温度（C）＞酵母接种量（A）＞初始加糖量（B）。各因素交互作用的响应面图和等高线图见图5。由图5 可知，发酵温度、酵母接种量、初始加糖量之间的交互作用对蓝莓果渣白兰地感官评分影响的响应面均呈现伞状，有最高点，等高线均呈现椭圆形，说明各因素间交互作用对蓝莓果渣白兰地的感官评分影响显著，与方差分析结果一致。

图5 各因素交互作用对对蓝莓果渣白兰地感官评分影响的响应曲面及等高线

表5 响应面回归模型方差分析

2.5.3 验证试验

经Design-Expert 8.0.6 分析软件得到的最优发酵工艺参数为发酵温度28 ℃、初始糖度217 mg/mL，酵母菌接种量0.3 g/L。为验证此工艺的准确性，按其参数进行验证试验，得到的蓝莓果渣白兰地感官评分为77.63±0.25，与预测值78.02接近，误差较小，证明响应面模型拟合效果较好，可用于蓝莓果渣白兰地的实际生产。

3 结论

本试验以蓝莓果渣为原料，以F33 酵母作为发酵菌种，通过单因素试验及响应面试验对蓝莓果渣白兰地的酿造工艺进行了优化，得出蓝莓果渣白兰地的最优酿造工艺参数为发酵温度28 ℃、初始糖度217 mg/mL，酵母菌接种量0.3 g/L，此条件下得到的蓝莓果渣白兰地感官评分为77.63 分±0.25 分，果香酒香浓郁，风味典型。本方法具有良好的应用前景，可为蓝莓果渣进一步加工利用提供依据。