副溶血弧菌QsvR ChIP-qPCR方法的建立

张苗苗, 李雪, 陆仁飞, 张义全, 周敏

(1. 南通大学附属南通第三医院检验科, 江苏 南通 226006; 2. 江苏大学医学院, 江苏 镇江 212013; 3. 南通市疾病预防控制中心微生物科, 江苏 南通 226007)

在转录调控机制研究中,通常需要测定调控蛋白质是否能与靶基因启动子区DNA序列相互作用并确定对应的作用位点,常用的实验方法为凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)和DNase I足迹实验[1]。然而,EMSA和DNase I足迹实验均属于体外实验,不能准确反映蛋白质在细菌体内的准确结合序列,而且常出现假阳性结果。此外,DNase I足迹实验还需要特殊的设备(如测序仪)或原材料(如放射性同位素),不适合作为实验室的常规实验方法。因此,急需要一种替代实验方法来解决上述问题。

染色质免疫共沉淀技术(chromatin immuno-precipitation,ChIP)是利用特异性抗原抗体反应,在基因组水平上研究生命体组织或者细胞内蛋白质与DNA相互作用的一种技术方法[2]。ChIP技术在真核生物中已经得到广泛的应用,具有多种相应的试剂盒,但是这些试剂盒并不适用于原核生物[3]。

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种革兰阴性嗜盐性弧菌,广泛存在于近海海水、海底沉淀物以及海产品中,感染后可引起以腹泻、腹痛、低烧、呕吐等为主要症状的急性肠胃炎[4]。副溶血弧菌可分泌多种毒力因子包括耐热直接溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)、耐热直接溶血素相关溶血素(TDH-related hemolysin,TRH)、Ⅲ型分泌系统(T3SS)和Ⅵ型分泌系统(T6SS)等[5-6]。AphA和OpaR分别是副溶血弧菌密度感应系统在低密度和高密度下的核心调控子,参与调控生物膜形成、毒力因子、运动等生命活动[7-9]。QsvR是AraC家族的转录调控子,与密度感应系统协同调控毒力基因的表达[1]。在低密度条件下,AphA间接抑制qsvR的转录;高密度时,OpaR间接激活qsvR的转录[1]。QsvR在高密度条件下表达量较高,主要在高密度条件下发挥调控作用,直接抑制和激活aphA和opaR的转录[1]。QsvR直接激活T3SS1相关基因exsBAD-vscBCD,T3SS2相关基因vtrA(vpa1332-1333)、vopB2(vpa1362-1358)和tdh2,T6SS2相关基因vpa1027-1024、vpa1043-1028和vpa1044-1046的转录[1,10]。此外,QsvR抑制相关极鞭毛基因的表达,而对侧鞭毛基因无调控作用,对生物膜的形成也具有一定的调控作用[11-12]。

本研究旨在建立副溶血弧菌中ChIP-qPCR的方法,为后续研究原核生物体内蛋白质和DNA序列相互作用的调控通路提供可靠的实验手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 副溶血弧菌RIMD2210633qsvR非极性突变株(ΔqsvR)、大肠埃希菌S17 λpir和重组质粒pBAD33-qsvR-2×Flag由南通大学附属南通第三医院检验科保存。

1.1.2 主要试剂 HI培养基(2.5%脑心浸肉汤培养基)购自美国BD Bioscience公司;抗Flag M2磁珠购自美国SigmaAldrich公司;即用型溶菌酶购自美国Epicentre Biotechnologies公司;蛋白酶抑制剂(PIC)购自瑞士Roche Applied Sciences公司;SuperReal荧光定量预混试剂彩色版(SYBR Green)和FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂购自天根生化科技(北京)有限公司;质粒提取试剂盒和PCR产物纯化试剂盒购自QIAGEN公司;TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司;抗Flag标签单克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自索莱宝生物科技有限公司。

1.2 pBAD33-qsvR-2×Flag重组质粒的热激转化

取100 μL大肠埃希菌S17 λpir感受态细胞于冰上融化,加入100 ng pBAD33-qsvR-2×Flag重组质粒,冰上孵育30 min。42 ℃、90 s进行热休克,立即冰浴2 min,加入900 μL事先预热的LB液体培养基(1% NaCl、1%胰蛋白胨和0.5%酵母粉),于37 ℃静置孵育1 h。4 ℃、4 000 r/min离心5 min,弃去900 μL上清液,将剩下100 μL菌液混匀,均匀涂布于含20 μg/mL氯霉素的LB平板(1% NaCl、1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉和1.5%琼脂)上,37 ℃培养出单克隆。选取3个单克隆以qsvR-RT-F/R和pBAD33-F/R为引物(表1),进行PCR鉴定[13],此时菌株记为S17/pBAD33-qsvR-2×Flag。

表1 所用引物序列

1.3 pBAD33-qsvR-2×Flag重组质粒的接合转移

取10 μL S17/pBAD33-qsvR-2×Flag和副溶血弧菌ΔqsvR甘油菌株分别接种至5 mL LB液体培养基中,37 ℃、200 r/min,培养12～14 h。分别取500 μL S17/pBAD33-qsvR-2×Flag和ΔqsvR,4 000 r/min离心5 min收集菌体,然后用1 mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,每次4 000 r/min离心3 min。分别用100 μL LB液体培养基重悬菌体,并混合在一起,取100 μL混合菌液点种在LB平板上。待菌液干燥后,将LB平板30 ℃静置培养6～8 h。用1 mL无菌PBS刮取LB平板上的菌斑,取100 μL涂布于含有5 μg/mL氯霉素和100 μg/mL氨苄西林的LB平板上,37 ℃静置培养至分离出单克隆。选取3个单克隆以toxR-RT-F/R、qsvR-RT-F/R和pBAD33-F/R为鉴定引物(表1),作PCR鉴定[13],此时菌株记为ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag。

1.4 细菌培养

取10 μLΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag甘油菌种接种于5 mL的HI肉汤中,37 ℃、200 r/min培养12 h。50倍稀释转接至5 mL HI肉汤中,37 ℃、200 r/min培养至D(600 nm)为1.2～1.4。1 000倍稀释转接至50 mL HI肉汤中,设置加阿拉伯糖诱导组(Ara+),未加阿拉伯糖诱导(Ara-)作为对照,37 ℃、200 r/min培养至D(600 nm)为1.0。氯霉素工作浓度为5 μg/mL,阿拉伯糖为0.1%。

1.5 蛋白质印迹实验检测QsvR-2×Flag蛋白

ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag菌株按照“1.4”方法培养后,分别取加阿拉伯糖和不加阿拉伯糖诱导的5 mL菌液,用PBS缓冲液悬起菌体并超声碎菌,4 ℃、12 000 r/mim离心10 min后,取上清液,用Micro BCATMProtein Assay Kit测定上清液中的总蛋白含量。取等量总蛋白的阿拉伯糖诱导和未诱导的裂解上清液进行10% SDS-PAGE电泳,而后转移至PVDF膜上,以抗Flag标签单克隆抗体为一抗,HRP标记的IgG为二抗,进行蛋白质印迹实验[14],通过比较特异性条带的差异来判断QsvR-2×Flag的表达量。

1.6 实时定量PCR检测qsvR mRNA的表达

ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag菌株按照“1.4”方法培养后,采用TRIzol法提取阿拉伯糖诱导和未诱导菌体的总RNA。分别取1 μg的总RNA,利用FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂盒将其逆转录成cDNA,然后用SuperReal荧光定量预混试剂彩色版(SYBR Green)通过实时荧光定量PCR仪进行qPCR分析[15]。以16S rRNA基因作为内参,采用2-ΔΔCt法对qsvR的表达水平进行相对定量,所用引物见表1。

1.7 DNA和蛋白质的交联

ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag菌株按照“1.4”方法培养后,分别取阿拉伯糖诱导和未诱导的菌液40 mL,添加1.1 mL 37%的甲醛溶液,置30 ℃、100 r/min下作用10 min。10 mL/管分装至无核酸酶离心管中,向每管中添加2.5 mol/L的甘氨酸溶液1 mL,4 ℃旋转孵育30 min。4 ℃、4 649×g离心10 min,沉淀用10 mL预冷的PBS洗涤2次,重悬于1 mL预冷的PBS中,随后补加25×蛋白酶抑制剂40 μL和100 mmol/L苯基甲基磺酰氟10 μL,混匀。4 ℃、16 000×g离心5 min,弃上清液,沉淀保存至-80 ℃冰箱中。

1.8 超声裂菌

分别取一管加阿拉伯糖诱导和未诱导的交联后菌体,用0.5 mL裂解液(10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、EDTA、14.5 kU/mL溶菌酶和20 μg/mL RNase A)重悬,37 ℃孵育30 min。加入0.5 mL 2×IP缓冲液(200 mmol/L Tris-HCl、600 mmol/L NaCl、4% Triton X-100、0.2×蛋白酶抑制剂和2 mmol/L苯基甲基磺酰氟),涡旋混匀。100 W超声裂菌,裂菌参数为超声裂解6 s、间隔6 s,共9 min。4 ℃、16 000×g离心10 min,每管上清液200 μL分装至无核酸酶EP管中。分别取出一管超声上清液添加4 μL 5 mol/L NaCl,65 ℃孵育4 h,充分涡旋混匀后,16 000×g离心3 min。将上层水相利用酚氯仿法提取总DNA,进行1%琼脂糖凝胶电泳分析,DNA片段应均在100～1 000 bp之间。

1.9 ChIP反应

分别取阿拉伯糖诱导和未诱导的超声裂解液上清液0.4 mL,其中0.2 mL用作Input样品,0.2 mL用作IP。用裂解液将IP样品补加到1 mL,加入到50 μL经平衡的抗Flag磁珠中,4 ℃旋转孵育过夜。用1 mL洗涤液1(100 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、250 mmol/L LiCl和2% Triton X-100)、洗涤液2(100 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、600 mmol/L NaCl和2% Triton X-100)和洗涤液3(100 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、300 mmol/L NaCl和2%Triton X-100)分别洗涤3次,再用TE洗涤液(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0和1 mmol/L EDTA)洗涤3次。将磁珠重悬于0.2 mL洗脱液(10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、1 mmol/L EDTA和1%十二烷基硫酸钠)中。洗脱产物于65 ℃孵育2 h,3 100×g离心30 s,上清液转移至无核酸酶EP管中。

1.10 去交联和qPCR

向Input和IP DNA中加入5 mol/L NaCl 8 μL,65 ℃孵育4 h,以去交联。加入0.5 mol/L EDTA 5 μL、10 μL 1 mol/L Tris-HCl pH 7.0和10 mg/mL蛋白酶K 2 μL,45 ℃孵育1 h。用PCR产物纯化试剂盒纯化Input和IP样品,用0.1～0.2 mL的无菌去离子水洗脱DNA。参考文献[16]的方法,实时定量PCR检测目标DNA(aphA、opaR、exsB和vtrA)的IP量,计算公式为2(Ct Input-Ct IP)。

1.11 统计学方法

应用GraphPad Prism 9.4.1和Visio Professional 2019进行相关统计学分析并进行绘图。qPCR实验至少形成3次独立实验,每次实验3个生物学重复,结果用均值±标准差表示,采用双尾t检验进行组间比较,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pBAD33-qsvR-2×Flag重组质粒的鉴定

将pBAD33-qsvR-2×Flag重组质粒热激转化进入大肠埃希菌S17 λpir,PCR鉴定结果见图1,相较于pBAD33空质粒,阳性克隆的pBAD33质粒中克隆入了qsvR基因片段,分子量较大,电泳条带滞后。

A:引物对为pBAD33-F/R;B:引物对为qsvR-RT-F/R;A4:pBAD33空质粒;B4:WT基因组DNA;A5和B5:无模板对照

2.2 ChIP-qPCR实验菌株的鉴定

将pBAD33-qsvR-2×Flag重组质粒结合转移入ΔqsvR中,获得ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag,PCR验证后,保存菌种用作实验菌株。提取ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag的总蛋白,蛋白质印迹实验显示,未加阿拉伯糖诱导的菌株中QsvR-2×Flag蛋白的表达低于检测下线,而经阿拉伯糖诱导的菌株QsvR-2×Flag蛋白大量表达。提取ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag的总RNA,qPCR结果可见,经阿拉伯糖诱导的菌株中qsvR的mRNA丰度是未加阿拉伯糖的130多倍。见图2。由此可见,阿拉伯糖诱导与否qsvR的表达量存在显著差异,可用无阿拉伯糖诱导的菌株ΔqsvR/pBAD33-qsvR-2×Flag作为本研究的对照组。

Ⅰ:PCR验证实验菌株,A:引物对为pBAD33-F/R;B:引物对为qsvR-RT-F/R;C:引物对为toxR-RT-F/R;A4:pBAD33空质粒;B4和C4:WT基因组DNA;A5、B5和C5:无模板对照。Ⅱ:蛋白质印迹。Ⅲ:qPCR,*:P<0.05

2.3 副溶血弧菌中QsvR的ChIP-qPCR

将pBAD33-qsvR-2×Flag重组质粒转入ΔqsvR中,经阿拉伯糖诱导后表达QsvR-2×Flag蛋白,在副溶血弧菌中可以与基因组DNA交联形成2×Flag-QsvR-DNA复合体,通过抗原抗体特异性反应将蛋白质-DNA复合体沉淀出来,解交联后获得与QsvR直接结合的DNA,利用qPCR分析可获得QsvR与DNA相互作用的信息。结果如图3所示,相较于未经阿拉伯糖诱导的菌株,经阿拉伯糖诱导菌株的aphA、opaR、exsB和vtrA的IP量明显较高,分别高3.68、8.02、9.44和8.05倍,表明在副溶血弧菌体内QsvR与aphA、opaR、exsB和vtrA具有结合作用。对于16S rRNA,二者之间没有明显的差异,表明QsvR与16S rRNA不结合。

*:P<0.05

3 讨论

ChIP是在活细胞状态下分析蛋白质与DNA相互作用的一种实验技术,可以弥补常用实验方法的不足。其原理是,靶蛋白质氨基酸序列末端标记特定标签,在菌体内与DNA进行交联,形成蛋白质-DNA复合物;提取菌体基因组DNA并将其裂解为100～1 000 bp大小不等的片段,经特定单克隆抗体与蛋白质中的标签进行特异性抗原抗体反应沉淀蛋白质-DNA复合物,解交联后收集DNA,利用qPCR检测蛋白质结合靶DNA的量[3]。ChIP不仅可以与qPCR相结合分析转录调控子与特定靶基因的相互作用信息,也可以结合测序技术来探究蛋白质的未知靶基因或者识别特定蛋白质在整个基因组中的所有靶基因[3]。目前,在原核生物中,已有ChIP应用的案例,例如,利用ChIP-qPCR确定了在大肠埃希菌体内与σ因子RpoE直接相互作用的靶基因[16];ChIP与测序技术相结合分析出溶藻弧菌(V.alginolyticus)基因组内DNA结合蛋白ToxR和LuxR的结合位点[17-18]。本研究对交联、免疫沉淀反应和解交联等步骤进行了优化,以副溶血弧菌中调控子蛋白QsvR为研究对象,成功建立了ChIP-qPCR实验技术,并验证了其准确性和稳定性。

QsvR是AraC家族的DNA结合蛋白,在副溶血弧菌中与密度感应系统的两个核心调控子AphA和OpaR协同调控毒力和生物膜相关基因的转录[1,11]。体外的凝胶阻滞实验和DNase Ⅰ足迹实验表明QsvR与aphA(-312…-175)、opaR(-190…-72)、exsB(-200…-88)和vtrA(-148…-67)启动子区DNA片段具有结合作用,与16S rRNA片段无结合作用[1]。本研究建立了副溶血弧菌中的ChIP-qPCR,并且验证了体外实验的结果,经阿拉伯糖诱导的菌株aphA、opaR、exsB和vtrA的IP量比未诱导菌株明显升高,表明QsvR与aphA、opaR、exsB和vtrA具有直接的结合作用,解决了没有相应试剂盒的困境,为后续研究原核生物体内调控通路提供了可靠的实验手段。