不同产地苹果的品质成分分析与产地判别

谭椰子 李 涛 王 玉 张红妮 胡 鹏

（平凉市食品检验检测中心， 甘肃 平凉 744000）

红富士苹果作为我国苹果的主要品种[1]， 其产量占全国苹果总产量的70%左右[2]。 然而， 近年来一些不法商家为牟取暴利， 在苹果流通过程中掺杂掺假、 以次充好， 冒充国家地理标志保护产品， 这种行为不仅使生产者和消费者遭受经济损失， 还严重扰乱市场秩序， 而且增加了农产品安全监管难度[3～4]。 因此， 亟需开展红富士苹果产地溯源的相关研究， 为苹果地理标志产品的品牌保护提供技术支撑， 保护生产者和消费者的合法权益， 促进苹果产业健康发展。

目前， 国内外学者对农产品产地溯源的研究主要是利用同位素和无机矿质元素在不同产地农产品中的差异性进行产地判别， 基于品质成分等进行相关研究较少。 而学者对于品质成分的研究主要是基于苹果中有机酸[5～8]、 酚类物质[9～12]和抗坏血酸[13～16]等进行果品品质分析， 对于苹果中有机成分在不同产地间的差异性研究较少。 研究表明， 利用有机成分可以对农产品进行产地溯源[17]。 苹果中有机酸、 多酚和维生素C 等品质成分的组成和含量在不同产地间会表现出一定差异特征[17]， 通过分析差异性可以在一定程度上达到苹果产地溯源的目的。 本研究以甘肃省静宁县苹果、 山东省烟台市苹果和陕西省洛川县苹果为研究对象， 采用高效液相色谱方法（High performance liquid chromatography，HPLC）， 对红富士苹果的品质成分（有机酸、 多酚和抗坏血酸） 的含量进行检测， 利用单因素方差分析、 主成分分析 （Principal component analysis，PCA）、 偏最小二乘法判别分析（Partial least squares discriminant analysis， PLS-DA） 和线性判别分析法研究3 个产地红富士苹果品质成分的差异特性，探讨利用品质成分对红富士苹果产地溯源的可行性， 以期为苹果产地溯源和苹果品质控制提供参考依据。

一、 材料与方法

（一） 材料与试剂本研究所用95 份苹果样品采自甘肃静宁、 山东烟台和陕西洛川红富士果园，其中甘肃静宁苹果样品32 份、 山东烟台苹果样品36 份、 陕西洛川苹果样品27 份。

草酸、 琥珀酸、 酒石酸、 柠檬酸、 苹果酸、 乙酸、 乳酸、 富马酸、 异柠檬酸、 甘油酸、 乙醛酸、草酰乙酸和奎宁酸标准物质 （纯度99%， 天津阿尔塔科技有限公司）； 儿茶素、 根皮苷、 绿原酸、芦丁、 表儿茶素、 槲皮素、 没食子酸、 表儿茶酸、对香豆酸、 二氢查耳酮和抗坏血酸标准物质（纯度99%， 坛墨质检科技股份有限公司）。

（二） 仪器与设备TLE 千分之一电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司］； T25 高速匀浆机、 KS4000 艾卡可控温振荡摇床、 RV10旋转蒸发仪、 Vortex-Genie 2 旋涡混合器（艾卡广州仪器设备有限公司）； SPE-12A 固相萃取装置（北京成萌伟业科技有限公司）； CTH2050R 台式高速冷冻离心机 （湖南赫西仪器装备有限公司）；LC-20AT 高效液相色谱仪（岛津中国有限公司）。

（三） 实验方法有机酸的检测参照GB 5009.157-2016 《食品安全国家标准 食品中有机酸的测定》； 草酸含量的检测根据郭燕等[18]的方法改动前处理部分， 改为均质、 超声、 离心、 残渣再超声、 离心、 合并上清液至100 mL 容量瓶中， 过0.45 μm 水膜， 上机； 多酚的检测参照NY/T 2795-2015 《苹果中主要酚类物质的测定 高效液相色谱法》； 抗坏血酸的检测参照GB 5009.86-2016 《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》 第一法。

（四） 数据统计方法运用Excel 对数据进行整理， 采用SPSS 26 软件对数据进行方差分析， 利用SIMCA-P 14.1 软件做PCA 和PLS-DA， 将特征指标录入SPSS 26 软件进行判别分析。

二、 结果与讨论

（一） 红富士苹果中有机酸、 多酚和抗坏血酸含量及差异性分析对甘肃静宁、 山东烟台和陕西洛川共95 份红富士苹果样本中儿茶素、 表儿茶素、根皮苷、 槲皮素、 绿原酸、 芦丁、 对香豆酸、 没食子酸、 表儿茶酸、 二氢查耳酮、 抗坏血酸、 草酸、琥珀酸、 酒石酸、 柠檬酸、 苹果酸、 乙酸、 乳酸、富马酸、 异柠檬酸、 甘油酸、 乙醛酸、 草酰乙酸和奎宁酸共24 种品质成分进行检测。 在大多数苹果样本中， 有机酸中异柠檬酸、 甘油酸、 乙醛酸、 草酰乙酸和奎宁酸未检出， 多酚物质中没食子酸、 表儿茶酸和二氢查耳酮均未检出， 检出成分含量（用平均值±标准差表示） 见表1。

表1 不同产地红富士苹果中品质成分含量比较分析

由表1 可知， 检出指标中苹果酸含量最高， 平均含量在2997.71～3375.05 mg/kg 之间， 是红富士苹果中有机酸的主要种类之一， 其次是绿原酸（86.25～135.42 mg/kg） 和琥珀酸 （53.52～128.20 mg/kg）。 对香豆酸和富马酸在所有品质成分中含量相对较低， 并且这两种成分在3 地苹果中均表现出较大程度离散， 这可能是因为苹果个体差异较大，也可能是因为其在苹果中的状态和分布具有一定差异。 苹果中品质成分差异性分析表明， 儿茶素、 根皮苷、 槲皮素、 绿原酸、 芦丁、 抗坏血酸、 草酸、琥珀酸、 酒石酸、 柠檬酸、 苹果酸、 乙酸、 乳酸等13 种品质成分的含量在不同产地红富士苹果间具有差异性（p＜0.05）， 这可能与苹果产地的气候[19～20]、土壤环境及果园管理[21～22]等因素有关， 而这些影响因素在一定区域内基本趋同， 因此这些差异性指标携带了一定的产地信息， 可以利用其对苹果进行产地溯源。

（二） 红富士苹果差异性品质成分PCA为了验证差异性品质成分用于红富士苹果产地判别的可行性， 对95 份苹果样本的13 种差异性指标进行PCA。 根据方差累积解释率＞80%原则， 选取可以包含较多产地信息的前7 个主成分 （见表2）。 载荷系数绝对值大于0.4 的表示该指标对该主成分贡献力较大， 其中第1 主成分包含了30.177%的分组信息， 儿茶素、 槲皮素、 绿原酸、 芦丁、 抗坏血酸、 草酸、 琥珀酸、 酒石酸、 乙酸和乳酸对第1 主成分的贡献力最强； 第2 主成分方差解释率为12.368%， 主要包含了酒石酸、 柠檬酸和苹果酸的分组特征信息； 第3 主成分主要代表了根皮苷、 草酸和苹果酸指标； 第4 主成分代表了草酸和乳酸；第5 主成分代表了槲皮素； 第6 主成分代表了乳酸。 前2 个主成分中涵盖了所有品质成分指标。 为方便可视化， 利用前2 个主成分得分做散点图（见图1）。 从图1 看， 3 个产地苹果样本虽然在一定程度上实现了分组， 但是分离度较差， 边际重叠， 尤其是静宁苹果有一部分距离聚类中心较远。 因此，利用这13 种品质成分对红富士苹果进行产地判别具有一定的可行性， 但是数据冗余复杂， 干扰较多， 分类效果不理想， 需进一步优化分析。

图1 红富士苹果品质成分PCA 得分图

表2 主成分载荷系数

（三） 红富士苹果差异性品质成分PLS-DA不同于PCA， PLS-DA 是一种有监督变量的分析方法， 可以有效筛除部分重叠信息， 并且可以根据变量在主成分的重要性投影筛选出分组贡献力强的特征指标， 利用这些指标进行分析可以降低干扰和分析维度[23]。 对95 份苹果样品中差异性显著 （p＜0.05） 的13 种品质成分进行PLS-DA，X轴累积解释率R2X＝0.673，Y轴累积解释率R2Y＝0.732，模型累积预测率Q2＝0.689， 均大于0.6， 说明有效降低了干扰和分析维度。 样本在二维得分散点图（见图2） 分组效果明显优于PCA， 样本离散度变小， 3 个产地的苹果样品基本分布在不同区域。 以变量重要性投影（Variable importance in projection，VIP） 值＞1 为条件[24]， 共筛选出7 种分组能力较强的品质成分 （见图3）， VIP 值由大到小依次为酒石酸、 芦丁、 根皮苷、 绿原酸、 琥珀酸、 抗坏血酸和乙酸。 但这7 种特征指标对红富士苹果样品的产品判别效果无法量化， 仍需进一步验证。

图2 红富士苹果品质成分PLS-DA 得分图

图3 红富士苹果品质成分PLS-DA 的VIP 值

（四） 红富士苹果品质成分线性判别分析线性判别是将标记有分类组别的若干数量特征投影到一条直线， 根据该直线上样本投影值达到类别间的距离来确定线性判别函数的系数， 从而建立线性判别函数[25]。 为了进一步分析酒石酸、 芦丁、 根皮苷、 绿原酸、 琥珀酸、 抗坏血酸和乙酸这7 种品质成分的产地判别效果， 对95 份样本的这7 种指标做线性判别分析。

以全部样本建立判别函数， 采用“留一法” 进行交叉验证， 结果见表3， 所建模型判别率为98.9%， 交叉验证的准确率达96.8%。 训练集中，有1 个陕西洛川苹果误分到了山东烟台分组， 验证集中， 2 个陕西洛川苹果样品分别被误判到山东烟台和甘肃静宁分组， 1 个甘肃静宁苹果样品误判到陕西洛川分组。 造成误判可能与样本个体差异有关， 表现为样本的部分指标所表达的产地信息与实际不符， 其所表达的产地信息可能受到树种、 施肥和气候等因素的影响。 有研究表明， 同地区不同品种的苹果中品质成分也存在一定差异[26]， 而本研究为考虑覆盖范围， 涉及宫崎短枝、 烟富3 号、 长富2号等多个红富士品种。 全部样本建立的判别函数为：

表3 判别分析分类结果a，b

式中，Y甘肃静宁、Y山东烟台、Y陕西洛川分别为甘肃静宁、 山东烟台和陕西洛川产地的红富士苹果的判别函数值；X根皮苷、X绿原酸、X芦丁、X抗坏血酸、X琥珀酸、X酒石酸、X乙酸分别为苹果中根皮苷、 绿原酸、 芦丁、抗坏血酸、 琥珀酸、 酒石酸和乙酸含量（mg/kg）。

同时随机选取70%样本作为训练集建立判别函数， 30%样本数据检验函数准确性， 结果见表4。 模型验证测试集的准确率均为100%， 训练集的准确率均大于88%， 其中2 个陕西洛川的苹果样品分别被误判为甘肃静宁和山东烟台产地。 相较于全部样本进行训练， 模型的判别率和验证率均有改变， 说明样本量的变化会对模型稳定性产生影响， 而训练集样本量的降低减小了模型适应范围，导致预测准确率下降。

表4 70%样本训练分组及预测结果

综合两种方法所建模型可以看出， 两个模型对3 个产地红富士苹果的产地判别和验证正确率均超过88%， 说明基于酒石酸、 芦丁、 根皮苷、 绿原酸、 琥珀酸、 抗坏血酸和乙酸这7 种品质成分对3个产地红富士苹果进行产地判别较为稳定可靠， 在一定程度上能够判别红富士苹果的产地。

三、 结论

本研究以甘肃静宁、 山东烟台和陕西洛川3 个产地的红富士苹果为研究对象， 利用高效液相色谱仪测定有机酸、 多酚和抗坏血酸共24 种品质成分的含量， 结合多元统计分析构建红富士苹果产地判别模型， 探讨基于品质成分含量差异的苹果原产地判别的可行性。 结果表明， 基于差异性成分指标对不同产地的苹果进行产地分类具有一定的可行性，利用PLS-DA 筛选出的酒石酸、 芦丁、 根皮苷、绿原酸、 琥珀酸、 抗坏血酸和乙酸7 种品质成分可对3 个产地苹果进行一定程度的产地区分， 所建判别函数的判别和验证正确率均超过88%。

本研究在前人研究的基础上， 将PCA、 PLSDA 与线性判别分析相结合， 利用品质成分对苹果进行产地溯源分析， 研究结论可为红富士苹果的产地判别提供理论依据， 也可为苹果品质控制提供技术支撑。 但基于品质成分在苹果生长和流通过程中稳定性不强的特征， 进行苹果产地溯源模型的研究时， 要综合考虑苹果成熟度、 贮藏条件和周期等因素， 同时需要与矿质元素、 同位素和香气成分等其他指标相结合， 来进一步提升产地判别模型的准确度和适应性。