改良QuEChERS-气相色谱-串联质谱法测定茶叶中43 种农药残留

2023-11-24谷瑞丽刘霞丽宁亚萍姚晓洁

农产品质量与安全 2023年6期

谷瑞丽刘霞丽宁亚萍姚晓洁刘璐夏嘉

（1.河南省食品和盐业检验技术研究院，郑州 450003； 2. 国家市场监管重点实验室（食品安全快速检测与智慧监管技术），郑州 450003）

我国是茶叶生产和消费大国。自唐代以来，我国西南地区兴起的茶马古道[1]就是以茶叶为主要交易内容的商品贸易通道；此外，茶叶还是古代“丝绸之路” 贸易中的重要商品，这些都彰显了我国茶叶历史的悠久[2]。茶叶中富含较多的有益成分[3]，但是由于茶树种植过程中茶农存在不规范使用农药的情况，故茶叶的农药残留问题难以避免[4]。从国家实施食品安全抽检工作以来，茶叶的农药残留监测工作就一直在进行中[5～6]。我国在GB 2763-2021 《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》[7]和GB 2763.1-2022 《食品安全国家标准食品中2， 4-滴丁酸钠盐等112 种农药最大残留限量》[8]中共规定了110 项茶叶农药残留限量指标。然而，茶叶农药残留超标的情况仍有发生[9]，对茶叶的消费[10]和出口造成很大的损失[11～12]。

近年来，农药残留检测方法朝着快速、方便、灵敏、安全、低成本以及高通量方向发展。 2003年，美国农业部ANASTASSIADES 教授等开发了QuEChERS （Quick， easy， cheap， effective， rugged and safe）法[13]。后来GB 23200.113-2018 《食品安全国家标准植物源性食品中208 种农药及其代谢物残留量的测定气相色谱-质谱联用法》[14]和GB 23200.121-2021 《食品安全国家标准植物源性食品中331 种农药及其代谢物残留量的测定液相色谱-质谱联用法》[15]，都在通过QuEChERS 前处理方法结合液相色谱-质谱联用法或气相色谱-质谱联用法实现农药残留的高通量检测，达到快速监测的目的。近期研究人员也是基于QuEChERS 法，在粮食作物[16]、果蔬[17～19]、食用菌[20]、茶叶[21～22]及中药材[23]中建立了农药残留的筛查方法。本研究也旨在基于QuEChERS 前处理技术结合气相色谱-串联质谱法（Gas chromatography-tandem mass spectrometry， GC-MS/MS），扩大茶叶中农药残留检测的范围，实现对茶叶中多农药残留的高通量检测，以期为茶叶农药残留风险监测提供有力保障。

一、材料与方法

（一）材料与仪器标准物质中茵草敌、兹克威、丁草敌、氯草定等均为100 μg/mL 的标准溶液，分别来自农业农村部环境保护科研监测所、坛墨质检科技股份有限公司、 Dr.Ehrenstorfer GmbH等，内标乙酸乙酯中外环氧七氯溶液10 μg/mL，来自天津阿尔塔科技有限公司；石墨化碳黑（Graphitized carbon black， GCB）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（Primary secondary amine， PSA）、C18均来自天津博纳艾杰尔公司；乙腈、乙酸乙酯为色谱纯，默克化工有限公司；醋酸为色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；氯化钠（NaCl）、醋酸钠、无水硫酸镁（MgSO4）为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；净化管1 号15mL （45mg GCB、 150 mg PSA、 50 mg C18、 900 mg MgSO4）、净化管2 号15 mL （45 mg GCB、 400 mg PSA、400 mg C18、 1200 mg MgSO4）、净化管3 号15 mL（400 mg GCB、 400 mg PSA、 400 mg C18、 1200 mg MgSO4），均购自美国安捷伦公司。

8890-577B 气相色谱-串联质谱联用仪，配有电子轰击离子源（EI），美国安捷伦公司； DB-5MS 色谱柱（30 m×0.250 mm， 0.25 μm），美国安捷伦公司； MV-3000 多位涡旋振荡器，广东晋元仪器有限公司； SIGMA 4-16K 高速冷冻离心机，德国SIGMA 实验室离心机有限公司。

（二）实验方法

1. 样品的提取和净化。将茶叶样品搅碎后混匀，准确称取2 g （精确至0.01 g）于50 mL 塑料离心管中，加入10 mL 水涡旋溶解，静置30 min。随后加入10 mL 乙腈溶液（含1%醋酸）、 6 g MgSO4、 1.5 g 醋酸钠及1 颗陶瓷均质子，盖上离心管盖，剧烈振荡1 min 后以5000 r/min 离心5 min。吸取6 mL 上清液加到内含1200 mg MgSO4、400 mg PSA、 400 mg C18、 400 mg GCB 的15 mL塑料离心管中，涡旋混匀1 min。以4200 r/min 离心5 min，准确吸取1 mL 上清液，氮吹近干，加入10 μL 内标乙酸乙酯中外环氧七氯溶液，加入1 mL 乙酸乙酯复溶，混匀过滤后上机测定。

2. 溶液配制。（1）混合标准工作溶液。分别准确量取标准溶液各1 mL，用乙酸乙酯定容至10 mL，混匀得到浓度为10 μg/mL 的混合标准储备溶液，在-20℃冰箱保存。随后准确移取混合标准储备溶液100 μL 用乙酸乙酯定容至1 mL，得到浓度为1 μg/mL 的混合标准工作溶液（临用现配）。（2）空白基质溶液。称取阴性空白的茶叶样品，按照 “1.样品的提取和净化” 方法提取、净化，取1 mL 空白基质溶液氮气吹干，用乙酸乙酯复溶成基质空白溶液，于-20℃冰箱保存。（3）基质标准工作溶液。在空白基质溶液加入混合标准工作溶液复溶，分别依次稀释成浓度为0.005、 0.010、 0.020、0.050、 0.100、 0.200、 0.500 μg/mL 的系列基质标准溶液，同时加入10 μL 浓度为10 μg/mL 的内标乙酸乙酯中外环氧七氯溶液，过微孔滤膜配制成系列基质标准工作溶液。

3. 检测条件。色谱条件：进样口温度280℃；采用程序升温，初始温度为100℃，保持1 min，以20℃/min 升至280℃保持3.5 min 。载气为高纯氦气（≥99.999%）；载气流速1.2 mL/min；进样体积1 μL，不分流进样。

质谱条件：离子源温度280℃；传输线温度280℃；检测方式为多反应离子监测模式（Multiple reaction monitoring， MRM）。 MS1 四极杆温度150℃； MS2 四极杆温度150℃。

（三）数据处理采用Agilent MassHunter 软件进行数据采集及处理。

二、结果与分析

（一）质谱条件的优化安捷伦8890-577B 气相色谱-串联质谱联用仪的NIST 软件库中自带的化合物数据库包含超过1000 种化合物，能满足应用GC 分析的常规化合物，将每个化合物SCAN 模式下的离子信息与NIST 软件库的标准谱库进行对比分析。对于软件库中没有的化合物，通过查阅相关文献获得母离子和子离子信息，再用单个标准品优化碰撞能，最终确定了43 种农药化合物的采集参数（见表1）。采用按时间分段MRM 检测混合标准溶液得到的总离子流图见图1。

图1 43 种农药化合物的总离子流图（0.500 μg/mL）

表1 43 种农药化合物离子采集参数

（二）提取溶剂的选择茶叶中含有大量色素、茶叶碱和咖啡因，会对目标农药的准确定量造成较大影响，因此前处理比较复杂。由于本研究检测的农药化合物较多，其理化性质存在较大差异，为了能充分提取被测农药的残留量，同时尽量少地将茶叶中杂质和色素溶解出来，参考了相关文献研究[24～27]，选择使用1%醋酸乙腈溶液作为提取溶剂。同时，考察发现1%醋酸乙腈溶液作为提取溶剂时， 43 种农药化合物的平均回收率在60%～120%之间。

（三）净化剂的优化QuEChERS 技术中常用的净化材料有GCB、 PSA、 C18[28]。还有研究表明，新型碳纳米管材料[29]及石墨烯材料[30]净化效果更好，但是从食品安全抽检的成本考虑，这些净化材料价格偏高。本研究为进一步提高QuEChERS 的提取效率及净化效果，重点对MgSO4、 PSA、GCB、 C18的用量进行了优化，对比了3 种净化管的净化效果。对比3 种净化管可以看出，净化管3号中增加了GCB、 PSA 的用量，它们对提取液中茶多酚和叶绿素有很强的净化作用；同时MgSO4的用量也增加，该物质具有改善净化效果的能力。最终实验结果也证实，采用3 号净化管净化后43 种农药的回收率（90.3%）高于1 号管（81.4%）和2 号管（86.5%），且净化后的样品颜色相对更澄清。因此，最终采用3 号净化管的净化剂配比。

（四）基质效应茶叶成分复杂，在质谱分析中可能产生基质效应（Matrix Effect， ME），导致农药化合物在仪器上的响应增强或者减弱，对农药化合物的含量分析产生影响。其计算公式为ME＝B/A×100%，其中，A为纯溶剂标准溶液中农药化合物的响应值，B为空白基质标准溶液中同一农药化合物的响应值。 ME 低于80%为强基质抑制效应， ME 在80%～＜100%之间为弱基质抑制效应，ME 在＞100%～120%之间为弱基质增强效应。取溶剂配制浓度为0.050 μg/mL 的纯溶剂标准溶液和空白基质标准溶液，经检测，得出19 种农药化合物存在弱基质增强效应。

（五）线性方程、定量限选取茶叶样品做1份基质空白，将混合标准工作溶液配制成浓度为0.005、 0.010、 0.020、 0.050、 0.100、 0.200、 0.500 μg/mL 的系列基质标准工作液。前处理的稀释倍数为10，以目标化合物浓度为横坐标（x），对应峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线。结果显示，部分农药在0.005 μg/mL 基质标准工作液中检出，但是回收率偏低； 43 种农药化合物在0.010～0.500 μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99（见表2）。以能够满足中华人民共和国农业部第2386 号公告规定的回收率和相对标准偏差（Relative standard deviation， RSD）要求的最低添加水平为该基质中的方法定量限，经试验得到各农药化合物的定量限均为0.01 mg/kg （见表2）。

表2 茶叶中43 种农药化合物的线性方程、相关系数、定量限、回收率和相对标准偏差

（六）准确度和精密度43 种农药中茵草敌、兹克威、丁草敌、氯草定等25 种在茶叶中没有农药残留限量标准，其他18 种农药的残留限量值分布在0.01～0.2 mg/kg 之间。参考此限量值情况分别设定0.010、 0.050、 0.100 μg/mL 3 个浓度水平，在空白茶叶中进行添加，每个添加水平重复测定6次。结果显示， 43 种农药化合物在茶叶中的平均添加回收率在61.3%～114.6%之间， RSD 为1.0%～11.1%（见表2），方法回收率和精密度均满足农药残留检测要求[31]。

（七）实际样品测定在河南省各地市批发市场、超市、农贸市场随机抽取茶叶样品27 份，用建立的方法对其进行农药残留测定。本方法中，农药残留检出值低于0.01 mg/kg 时，视为未检出。检测结果显示， 27 份茶叶样品中有3 份样品有农药检出，分别为2 份样品检出茵草敌， 1 份样品检出苯氟磺胺。

三、结论

本研究建立了基于改良的QuEChERS 前处理方法结合GC-MS/MS 法同时测定茶叶中茵草敌、兹克威、丁草敌、氯草定、氟乐灵、硫线磷、特丁硫磷亚砜、五氯甲氧基苯、特丁通、戊炔草胺等43 种农药残留的分析方法，验证了方法定量限为0.01 mg/kg，在低、中、高3 个添加水平（0.010、0.050、 0.100 μg/mL）下的回收率为61.3%～114.6%， RSD 为1.0%～11.1%。对27 份实际茶叶样品进行检测，也能完成样品的检测分析要求。方法操作步骤简单、效率高、净化效果好、准确度高，能够实现茶叶中多种农药残留的检测，为高效和准确地测定茶叶农药残留提供了新的分析手段。