超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱测定新型饲料添加剂枯草三十七肽

赵新雪 金银姬 姚 婷 李文香 索德成 王 石 莫 凡 肖志明

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所， 北京 100081； 2.北京市畜牧总站， 北京 100101；3.北京市兽药饲料监测中心， 北京 100107； 4.河北省兽药饲料工作总站， 石家庄 050035）

畜禽养殖中长期不规范使用饲用抗生素， 会导致药物残留、 细菌耐药性和环境污染等问题， 从而严重危害人类健康。 中华人民共和国农业农村部公告第194 号规定自2020 年1 月1 日起， 退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种， 我国饲料行业进入 “全面禁抗” 时代[1～2]。 然而， 饲料全面禁抗后也带来了畜禽死亡率增加、 生产性能下降等问题， 生产效益大幅降低[3～4]。 研制绿色、 安全的抗生素替代品， 是当前畜牧养殖业发展面临的一项重大研究课题[5]。 近年来， 以益生菌、 酶制剂、植物提取物、 免疫调节肽等为代表的一大批替抗产品应运而生， 特别是免疫调节肽作为理想的抗生素替代品， 受到各方广泛重视。

抗菌肽 （Antimicrobial peptide） 是一类具有抗感染功能的生物活性肽， 不仅具有广谱抗菌活性，还能够调节机体免疫功能和改善肠道环境， 是生物体先天性免疫防御系统的重要组成部分[6～7]。 抗菌肽主要通过直接抑制或杀灭致病菌和调节机体免疫功能两个途径发挥抗感染作用， 但不同于抗生素，由于其作用靶位多， 作用机制独特（如破坏病原体膜结构的完整性）， 因此在使用过程中不易产生耐药性， 无残留和绿色安全[8～11]。 枯草三十七肽（Sublancin） 是由37 个氨基酸组成的大分子多肽[12～14]，是我国首个获得批准使用的抗菌肽新型饲料添加剂， 中华人民共和国农业农村部公告第614 号规定了其在肉鸡饲料中使用， 推荐添加量为1.5～6.0 mg/kg。 作为一种新型替抗产品， 枯草三十七肽可以通过调节先天免疫反应和微生物菌群来防控耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染， 改善肠黏膜形态结构和菌群组成， 具有显著促生长、 增强机体免疫功能[15～18]。

目前， 关于枯草三十七肽检测方法的相关报道匮乏， 主要有液相色谱法（HPLC）[19]， 但HPLC 灵敏度低、 抗干扰能力差， 仅适用于纯品和相关添加剂产品的检测， 无法检测饲料中的枯草三十七肽。此外， 已有将液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）用于抗菌肽鉴别和检测的研究报道[20]。 然而， 我国尚无饲料中枯草三十七肽的检测方法标准， 难以对枯草三十七肽进行产品质量控制， 进而保障添加剂量， 因此亟需建立一种检测饲料中枯草三十七肽的检测方法。 为准确控制饲料中枯草三十七肽的含量， 本研究拟建立采用超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱（UPLC-QTRAP/MS） 测定饲料中枯草三十七肽的方法。

一、 材料与方法

（一） 仪器与试剂AB SCIEX QTRAP 6500+型超高效液相色谱-三重四极杆/ 复合线性离子阱质谱仪 （美国AB SCIEX 公司）， 配有电喷雾电离源 （ESI 源）； 3K15 低温高速离心机 （德国Sigma公司）； Milli-Q plus 超纯水仪 （美国Millipore 公司）； BS 210S 分析天平 （德国Sartorius 公司）；MS2 Minishaker 旋涡振荡器 （德国IKA 公司）；SK5200LHC 型超声波清洗仪 （上海科导超声器有限公司）； 恒温振荡器 （上海智城分析仪器制造有限公司）。

枯草三十七肽 （Sublancin） 对照品 （纯度≥86.3%）， 由北京曼哈格生物科技有限公司提供；甲醇、 乙腈 （色谱纯）， 购自德国Fisher 公司； 试验用水为经Milli-Q 纯化后的一级水 （＞18.2 MΩ）； 尼龙滤膜 （0.22 μm）， 购自上海安谱实验科技股份有限公司； 甲酸 （色谱纯）， 购自美国Sigma-Aldrich 公司。

（二） 样品前处理称取饲料样品5 g （精确至0.001 g）， 加入20 mL 甲醇-水-甲酸 （5∶3∶2，V∶V∶V）， 漩涡混合30 s， 超声提取30 min， 在10000 r/min 条件下离心5 min。 取上清液过0.22 μm 滤膜， 用甲醇-水-甲酸溶液（5∶3∶2，V∶V∶V） 适当稀释后上UPLC-QTRAP/MS 测定。

（三） 色谱和质谱条件色谱条件： 色谱柱为Agilent SB-Aq 柱 （100 mm×3.0 mm， 1.8 μm）；柱温40℃； 进样量5 μL； 流动相A 为0.1%甲酸水溶液， 流动相B 为0.1%甲酸乙腈溶液。 梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

质谱条件： 电喷雾电离源， 正离子模式（ESI+）； 采用分段采集， 离子化电压为5500 V；离子源温度为300℃； 气帘气压力138 kPa； 雾化气压力345 kPa； 辅助气压力345 kPa； 气帘气为空气， 脱溶剂气为高纯氮气， 碰撞气为高纯氮气； 碰撞室射入电压（EP） 10 V， 射出电压（CXP）13 V；采用多反应监测模式 （MRM） 测定， 枯草三十七肽MRM 离子对参数见表2。

表2 枯草三十七肽MRM 条件

二、 结果与分析

（一） 质谱条件优化用微量注射泵将枯草三十七肽标准溶液直接注入QTRAP/MS 质谱仪， 在正离子模式下进行全扫描， 以确定枯草三十七肽的分子离子峰。 枯草三十七肽是由37 个氨基酸缩合而成的大分子多肽， 7-36、 14-29 氨基酸由二硫键相连接， 具有非常稳定的三维结构， 其分子式为C162H254N50O51S5， 分子量3879.8 （见图1）[12]。 枯草三十七肽进入质谱后产生不同丰度的双电荷和三电荷离子， 据文献报道多肽类分子（如杆菌肽、 万古霉素、 硫酸粘杆菌素等） 由于含有较为丰富的氨基、 羧基、 羟基， 其MS/MS 分析也多以双电荷或三电荷离子作为母离子[21～25]。 因此， 最终选择丰度最高的双电荷离子[M+2H]2+m/z970.5 作为枯草三十七肽前体离子。 进一步通过子离子扫描得到二级质谱， 分别选择m/z较大、 强度比较稳定的930.1、 925.6 两个碎片离子作为子离子， 其中子离子m/z930.1 的响应强度最高且背景干扰小， 选定为定量离子对， 与另一个碎片离子m/z925.6 组成定性离子对。 根据美国食品药品监督管理局（FDA） 发布的2018 年版《生物制药分析方法验证指南》（《Bioanalytical Method Validation-Guidance for Industry》）， 确证某一化合物至少需要4 个识别点 （IP）， 母离子为1 个IP 点， 子离子为1.5 个IP点， 本研究选择母离子和两个子离子共4 个IP 点，满足检测方法要求[26]。 为提高分析灵敏度， 对离子源参数进行了系统优化， 包括雾化气流速、 加热气流速、 干燥气流速、 离子源温度和电压、 脱溶剂管温度， 气体参数和离子源温度优化结果见上文“（三） 色谱和质谱条件” 部分。 枯草三十七肽标准溶液MRM 谱图见图2。

图1 枯草三十七肽化学结构式

图2 枯草三十七肽标准溶液MRM 谱图（5 μg/L）

（二） 色谱条件优化本研究考虑出峰时间、分离效果、 峰形和灵敏度等因素， 分别考察了Waters BEH C18和Agilent SB-Aq 等色谱柱对枯草三十七肽的分离效果， 结果见图3。 结果显示， 在0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈流动相条件下， 选用Waters BEH C18色谱柱时， 峰形有拖尾现象； 选择Agilent SB-Aq 色谱柱时， 分离效果较好， 峰形尖锐。 Agilent SB-Aq 色谱柱使用独特的单官能团硅烷， 其具有较大的二异丙基 （SB-C8、 SB-C3、 SB-Phenyl、SB-CN 和SB-Aq） 侧链基团， 将对空间位阻有关键影响的硅氧烷键合到硅胶表面， 以避免硅胶在低pH 条件下被水解破坏。 Agilent SB-Aq 柱在低pH范围（最低可到pH 1） 分离时仍具有较长的柱效、柱寿命和重现性， 对酸性、 碱性和中性化合物均可提供出色的峰形。 为此， 本研究使用Agilent SBAq 色谱柱作为开发枯草三十七肽检测方法的首选。

图3 Waters BEH C18 （A） 和Agilent SB-Aq （B） 分离效果谱图

（三） 提取溶液选择多肽类化合物由多种氨基酸组成， 具有复杂的等电点和pKa， 对其进行有效提取一直是检测方法建立的难点所在。 本研究首先考察了甲酸水溶液、 甲醇、 乙腈、 水等多种溶液对枯草三十七肽的提取效果， 称取5 g 枯草三十七肽饲料添加剂样品， 加入20 mL 不同类型的提取溶剂， 振荡提取30 min， 在10000 r/min 条件下离心5 min。 取上清液过膜， 适当稀释后上UPLCQTRAP/MS 检测， 结果见图4A。 不同比例的乙腈提取效果均比较差， 50%甲醇、 20%甲酸、 50%甲酸提取效果相对较好， 但是只使用一种溶剂不能将目标物完全提取出来， 因此需进一步优化提取液。

图4 不同种类提取溶剂 （A） 和比例 （B） 对提取效果的影响（n＝5）

在此基础上， 尝试不同比例的甲醇、 水和甲酸对枯草三十七肽的提取效果， 结果见图4B。 可以看出， 提取液甲醇-水-甲酸（5∶3∶2，V∶V∶V）的提取效果最好， 回收率可达到96%以上。 甲酸能改变提取液的pH， 使提取溶剂在酸性条件下；甲醇有沉淀蛋白的作用， 从而使提取溶液更加澄清透明。 综合以上考察结果， 本研究选择甲醇-水-甲酸（5∶3∶2，V∶V∶V） 作为提取溶液。

（四） 超声和振荡提取选择在选定提取试剂的基础上， 进一步对超声提取和振荡提取效果进行了比较， 超声提取的平均回收率为98.5%±1.1%（n＝5）， 振荡提取的平均回收率为95.6%±4.7%（n＝5）， 提取回收率均在95%以上， 但超声提取稳定性更好、 操作更加简便， 因此本研究选择超声方式进行样品提取。

（五） 方法性能考察

1. 基质效应。 分别用空白鸡配合饲料、 浓缩饲料、 预混合饲料、 饲料添加剂等不同样品基质提取液将枯草三十七肽标准溶液稀释至1 μg/mL 浓度， 上UPLC-QTRAP/MS 测定， 结果见图5。 由结果可见， 鸡配合饲料、 浓缩饲料、 预混合饲料和饲料添加剂均存在严重的离子抑制， 基质效应在32%～63%之间。 通过将样品提取液做10 倍稀释后进UPLC-QTRAP/MS 分析， 基质效应为3.1%～8.6%， 显示通过稀释可显著降低基质干扰。 由于目前尚无商品化的枯草三十七肽氘代内标， 因此本方法采用基质匹配标准曲线进行定量分析， 并进行适当稀释， 以降低基质效应干扰。

图5 不同样品基质效应考察 （n＝5）

2.基质匹配标准曲线、 检出限（LOD） 和定量限 （LOQ）。 采用空白基质提取液配制浓度分别为0.5、 1、 5、 10、 20、 40、 50 μg/L 枯草三十七肽系列标准溶液， 以定量离子色谱峰面积与标准溶液的浓度作标准曲线， 结果见表3。 由结果可见， 不同基质标准溶液在0.5～50 μg/L 的浓度范围内线性关系良好， 相关系数≥0.9979。 依据定量离子色谱峰的3 倍信噪比（S/N） 为检出限（LOD）， 10 倍S/N为定量限 （LOQ）， 得出枯草三十七肽的LOD、LOQ 分别为0.05 mg/kg 和0.2 mg/kg， 方法LOQ远低于中华人民共和国农业农村部公告第614 号规定的枯草三十七肽添加量1.5～6.0 mg/kg。

表3 枯草三十七肽基质匹配标准曲线、 相关系数

3.准确度、 精密度和重现性。 选择具有代表性的空白饲料样品， 包括鸡配合饲料、 浓缩饲料、 预混合饲料和饲料添加剂进行添加回收试验。 根据美国FDA 2018 年版 《生物制药分析方法验证指南》要求[26]， 设置LOQ、 2 LOQ、 10 LOQ 和50 LOQ 4个添加浓度水平， 按上述方法进行样品处理和测定， 方法的准确度、 精密度和重现性结果见表4。结果表明， 对于饲料样品， 枯草三十七肽的平均回收率为86.4%～99.8%， 批内变异系数为1.2%～7.1%， 批间变异系数在2.9%～8.8%之间。

表4 饲料样品添加枯草三十七肽的回收率和变异系数

4.实际样品检测。 采用本方法对从饲料企业和养殖场随机收集的26 份饲料样品 （包括鸡配合饲料6 份、 鸡浓缩饲料6 份、 鸡预混合饲料5 份、 饲料添加剂9 份） 进行了检测， 所有配合饲料、 浓缩饲料和预混合饲料样品中均未检出枯草三十七肽，这可能是由于枯草三十七肽获批准时间较短， 尚未在饲料行业得到大范围使用。 然而， 在9 份饲料添加剂样品中共有3 份检出枯草三十七肽， 且含量较高， 分别为1.17×104、 1.06×104和1.12×104mg/kg。

三、 结论

研究建立了超高效液相色谱-三重四极杆/ 复合线性离子阱质谱 （UPLC-QTRAP/MS） 测定新型饲料添加剂枯草三十七肽的分析方法， 该方法在0.5～50 μg/L 浓度范围内呈现良好的线性关系， 枯草三十七肽的检出限为0.05 mg/kg， 定量限为0.2 mg/kg， 4 个添加水平下的平均回收率为86.4%～99.8%， 批内变异系数≤7.1%， 批间变异系数≤8.8%。 该方法操作简便、 快速、 稳定， 适用于饲料中枯草三十七肽的测定。