“通督启神”针法对APP/PS1小鼠肠道菌群的影响

郝 心,张 悦,孙润权,赵 俊,赵亚莉,李易冉,丁 宁,李志刚△

(1.北京中医药大学针灸推拿学院,北京 100029,2.北京中医药大学国际学院,北京 100029;3.中国中医科学院广安门医院,北京 100029)

阿尔茨海默病(AD)是一种与年龄和衰老相关的神经退行性疾病,以β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)沉积形成的老年斑(Senile plaque,SP)与tau蛋白过度磷酸化形成的神经元纤维缠结(Neurofibrillarytangles,NFT)为主要病理特征[1]。临床表现为进行性的认知和记忆衰退,视觉、语言和执行能力的丧失以及人格和行为的改变[2]。随着全球人口老龄化的加剧,AD的发病率逐年升高,对全球公共卫生系统构成巨大挑战[3]。

AD的发病与多种因素有关,其发病机制复杂且仍不确定。近几年的研究发现[4-6],肠道菌群能够通过“微生物-肠-脑轴”与中枢神经系统相互作用,影响大脑的生理、行为和认知功能,参与AD的发生发展。研究表明[7],在AD早期大脑病理完全发展之前即存在肠道菌群紊乱,而良性调节肠道菌群构成,恢复肠道菌群稳态有利于延缓并阻止AD的病情进展。团队前期研究表明,针刺可通过抗炎[8-11]、调节能量代谢[12-15]、抗氧化应激[16]与调节脑血流量[17-18]等多种机制缓解AD相关症状,且具有安全性高、不良反应少等特点。然而,针刺对APP/PS1小鼠肠道菌群的调节效应尚不明确。有鉴于此,本研究基于“通督启神”针法,采用Morris水迷宫和16S rRNA高通量测序技术,观察针刺对APP/PS1小鼠认知能力和肠道菌群的影响,探讨针刺改善APP/PS1小鼠认知功能的可能机制,为阐明针刺防治AD的肠道机制提供重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级6月龄雄性APP/PS1双转基因AD模型小鼠18只,随机分为模型组、针刺组和益生菌组,体质量(30±2)g;SPF级6月龄雄性C57BL/6小鼠6只作为正常组(N),体质量(30±2)g。以上实验动物均购于卡文斯百格(苏州)模式动物研究有限公司,由苏州西山生物技术有限公司检测[合格证:SCXK(苏)2018-0002]。实验动物饲养于北京中医药大学实验动物中心,温度(23±1)℃,湿度45%,12 h循环昼夜光照环境下单笼饲养,自由进食水。实验过程严格遵循中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》,通过了北京中医药大学的伦理审核(编号:bucm-4-2021102701-4032)。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 试剂 益生菌(每克含110亿活菌,包括乳双歧杆菌HN019、两歧双歧杆菌Bb06、动物双歧杆菌BB-12、乳双歧杆菌Bi07、长双歧杆菌R175、动物双歧杆菌B94、鼠李糖乳杆菌GG、干酪乳杆菌LC11、瑞士乳杆菌R52、副干酪乳杆菌Lpc37、植物乳杆菌R1012、罗伊氏乳杆菌HA188、鼠李糖乳杆菌R11、嗜酸乳杆菌NCFM和嗜热链球菌St21,中科宜康生物科技有限公司);DNA提取试剂盒(美国Omega公司);DNA凝胶回收试剂盒(美国Axygrn公司);琼脂糖(法国Biowest公司);NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit(美国Bioo Scientific公司);MiSeq Reagent Kit v3(美国I11umina公司)。

1.2.2 仪器 一次性无菌针灸针(0.25 mm×13 mm,北京中研太和药业有限公司);XR-XM101型Morris水迷宫及图像自动采集和软件分析系统(成都泰盟公司);分光光度计(NanoDrop2000,美国赛默飞公司);PCR仪(QuantStudio 6,美国ABI公司);测序仪(Miseg PE300,美国I11umina公司);高速冷冻离心机(5424R,Eppendorf);多功能酶标仪(ELx800,美国Biotek公司);微型荧光仪(QuantusTMFluorometer,美国Promega公司);研磨仪(FastPrep-24 5G,美国MP公司);电泳仪(DYY-6C,北京市六一仪器厂)。

1.3 干预方法

正常组和模型组在相同饲养条件下不做任何干预,仅在针刺组进行针刺干预的同时给予相同的抓取和鼠套束缚,20 min/次,1次/d,共56 d。针刺组参照第9版《实验针灸学》常用实验动物针灸穴位附图中的取穴方法及比较解剖学方法[19]选取百会穴、印堂穴和双侧足三里穴。百会穴和印堂穴向上平刺进针,进针深度为5 mm;足三里穴直刺进针,进针深度为4 mm。针刺过程中每隔5 min行小幅度捻转15 s。20 min/次,1次/d,共56 d。益生菌组用益生菌(8.7×108CFU/g)灌胃给药,并鼠套束缚20 min,1次/d,共56 d。

1.4 行为学检测

采用Morris水迷宫实验检测各组小鼠空间学习记忆能力。参照文献方法[20-21]并改进,Morris水迷宫实验在直径90 cm、高50 cm和深30 cm的水池中进行,水温保持在23～25 ℃。将直径9.5 cm、高28 cm的圆柱形平台放于第Ⅲ象限中央,并使其顶部位于水面下1～2 cm。实验51～55 d,每只小鼠每天进行4次隐蔽平台实验。以SE、NW、NE和SW为入水点,半随机将小鼠面朝池壁放入水中,如小鼠于60 s内找到平台则使其在平台上停留15 s;如小鼠60 s内未能找到平台则潜伏期记为60 s,并引导其至平台停留20 s。记录小鼠逃避潜伏期,并分析其游泳速度。实验第56天,撤除平台,小鼠由第Ⅰ象限入水,每只小鼠1次/d空间探索实验。分析其穿越原平台次数、目标象限(第Ⅲ象限)内的停留时间及游泳路程百分比。

1.5 肠道菌群检测

采用16S rRNA高通量测序技术检测各组小鼠肠道菌群的多样性、组成结构和功能。实验第57天,收集各组小鼠新鲜粪便样本于无菌冻存管中,随后放入-80 ℃冰箱中保存备用。样品16S rRNA检测由上海美吉生物医药科技有限公司完成。用DNA提取试剂盒提取细菌DNA,采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度,使用无菌水稀释样品。对稀释后的基因组DNA进行16S V3-V4区域的PCR扩增,纯化PCR产物并割胶回收目标条带。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库,采用Miseq PE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。基于生物信息云i-sanger平台,对OTUs进行不同水平物种注释。根据聚类结果,对粪便菌群进行物种多样性(α多样性、β多样性)、物种分类学组成和功能预测等方面进行分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 行为学检测结果

实验第1天各组小鼠逃避潜伏期比较差异无统计学意义。模型组第2～5天逃避潜伏期均显著高于正常组(P<0.01)。针刺组及益生菌组逃避潜伏期于隐蔽平台实验第3～5天与模型组比较显著降低(P<0.01或P<0.05),但仍高于正常组同期,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见表1。如表2所示,各组小鼠隐蔽平台实验的游泳速度在各时间点组间比较差异无统计学意义。如表3所示,在空间探索实验中,模型组穿台次数、目标象限游泳时间比及路程比均显著低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01);针刺组和益生菌组穿台次数、目标象限游泳时间比及路程比较之模型组显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),但针刺组目标象限游泳路程比仍显著低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组小鼠隐蔽平台实验逃避潜伏期比较

表2 各组小鼠隐蔽平台实验游泳速度比较

表3 各组小鼠空间探索实验结果比较

2.2 肠道菌群检测结果

2.2.1 肠道菌群多样性分析 模型组sobs指数、shannon指数和chao指数均显著低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01);针刺组和益生菌组sobs指数、shannon指数和chao指数与模型组比较均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。PCA分析结果显示正常组、针刺组和益生菌组的样本分布明显偏离模型组,针刺组和益生菌组样本间的分布接近。见表4、图1。

表4 各组小鼠肠道菌群α-多样性分析

2.2.2 门与属水平菌群组成分析 在门水平,正常组、针刺组与益生菌组小鼠的肠道菌群均以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主。模型组小鼠的肠道菌群以厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)为主。在正常组、模型组、针刺组与益生菌组中,厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度的占比依次为:19.77%、38.78%、25.31%和26%;拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度的占比依次为76.71%、25.82%、71.46%和66.92%;变形菌门(Proteobacteria)相对丰度的占比依次为0.61%、26.45%、0.08%和0.15%。见图2。如图3所示,在属水平,正常组、针刺组与益生菌组小鼠的肠道菌群主要包括Muribaculaceae、拟杆菌属(Parabacteroides)、另枝菌属(Alistipes)和毛螺菌属(Lachnospiraceae)等。模型组小鼠的肠道菌群组成主要包括肠杆菌属(Enterobacteriaceae)、Muribaculaceae、大肠杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)、丹毒丝菌属(Erysipelatoclostridiaceae)、副萨特氏菌属(Parasutterella)和布劳特氏菌属(Blautia)等。如图4所示,在门水平,与正常组相比,模型组厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01),拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01),厚壁菌门与拟杆菌门的比值(F/B)显著性升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,针刺组和益生菌组拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01),F/B比值与变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度显著降低(P<0.01)。如表5所示,在科水平,与正常组相比,模型组肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、巴斯德菌科(Pasteurellaceae)和萨特氏菌科(Sutterellaceae)的相对丰度显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),Bacteroidales的相对丰度显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,针刺组和益生菌组肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、巴斯德菌科(Pasteurellaceae)和萨特氏菌科(Sutterellaceae)的相对丰度显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),Bacteroidales的相对丰度显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。如表6所示,在属水平,与正常组相比,模型组大肠杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)、丹毒丝菌属(Erysipelatoclostridiaceae)和副萨特氏菌属(Parasutterella)的相对丰度均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),Muribaculaceae、拟杆菌属(Bacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotellaceae)、另枝菌属(Alistipes)和毛螺菌属(Lachnospiraceae)的相对丰度显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。与模型组相比,针刺组和益生菌组大肠杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)和副萨特氏菌属(Parasutterella)的相对丰度均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01),Muribaculaceae的相对丰度显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。针刺组丹毒丝菌属(Erysipelatoclostridiaceae)的相对丰度显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。

图2 各组小鼠肠道菌群在门水平的组成

注:N.正常组;AD.模型组;A.针刺组;M.益生菌组。图3 各组小鼠肠道菌群属水平的组成

图4 各组小鼠肠道菌群丰度有统计学差异的门水平物种比较

表5 各组小鼠肠道菌群丰度有统计学差异的科水平物种比较

表6 各组小鼠肠道菌群丰度有统计学差异的属水平物种比较

2.2.3 肠道菌群功能预测 如图5、表7所示,与正常组比较,能量产生和转换(Energy production and conversion)、氨基酸转运和代谢(Amino acid transport and metabolism)、核苷酸转运和代谢(Nucleotide transport and metabolism)、碳水化合物转运和代谢(Carbohydrate transport and metabolism)、脂质转运和代谢(Coenzyme transport and metabolism)、辅酶转运和代谢(Lipid transport and metabolism)及信号传导(Signal transduction mechanisms)等功能丰度在模型组中显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,上述功能丰度在针刺组和益生菌组中显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。

注:N.正常组;AD.模型组;A.针刺组;M.益生菌组。图5 各组小鼠肠道菌群COG功能分类统计柱状图

表7 各组小鼠肠道菌群有显著差异的功能丰度比较

3 讨论

“脑为元神之府”,“督脉者,上额,交巅上,入络脑”,基于“脑神”“督脉”的密切关系,李志刚教授创立“通督启神”针法治疗AD且疗效显著[22]。百会属督脉穴,与手足阳经交会于巅顶,可调动诸身之阳。印堂位于两眉正中,是人体“精、气、神”汇聚处。百会和印堂两穴配伍能够通调督脉、开窍醒神,纠正“神机失用”的直接病机。维持脑功能活动的重要物质既包括先天肾精又包括后天脾胃化生的精微物质。足三里穴为足阳明胃经合穴,胃之下合穴,可健运胃肠、化生气血和填精益髓,改善“髓海不足”的根本病机。选用百会穴、印堂穴,并配伍足三里穴,体现了标本兼治、肠脑并调的临床思路。

Morris水迷宫检测能够有效评估AD动物模型大脑学习记忆能力,广泛应用于学习记忆相关行为学检测及神经生物学研究中[23]。实验结果显示,各组小鼠在隐蔽平台实验中的游泳速度没有显著差异,说明各组小鼠游泳能力相同。模型组隐蔽平台实验第2～5天的逃避潜伏期与空间探索实验的穿台次数、时间比和路程比与正常组相比均有显著性差异,表明APP/PS1小鼠的空间学习与记忆能力显著减低。针刺和益生菌干预则显著逆转上述趋势,表明针刺及益生菌均能有效改善APP/PS1小鼠的学习记忆能力,这与之前的研究结果一致[24-25]。

人类胃肠道定植着大量的微生物群落,包括1 000多种细菌以及大约1 014个微生物[26]。在健康的个体中,肠道菌群维持在相对稳定的动态平衡状态。肠道菌群稳态的破坏会激活机体免疫系统并诱发神经炎症,导致AD的发生发展[27]。研究发现[28-29],正常成年人中肠道菌群的组成结构稳定,主要为厚壁菌门和拟杆菌门,AD患者则表现出肠道菌群多样性降低以及以拟杆菌门丰度降低、厚壁菌门和变形菌门丰度增加为特点的肠道菌群紊乱。厚壁菌门与拟杆菌门是胃肠道的两大优势菌门,二者比值(F/B)的增加会导致全身低级别炎症反应,与AD的发生有关[30]。科水平上Bacteroidales丰度的降低可贡献拟杆菌门丰度降低,进而导致F/B值的改变[31]。16S rRNA结果显示,模型组小鼠肠道菌群的多样性与拟杆菌门和Bacteroidales的丰度显著降低,厚壁菌门的丰度显著增加,F/B值显著增加。针刺和益生菌则显著增加了APP/PS1小鼠肠道菌群的多样性,降低F/B值。该结果表明针刺能够改善APP/PS1小鼠肠道菌群的多样性,纠正厚壁菌门与拟杆菌门比例失调,恢复肠道菌群的动态平衡,且与益生菌作用相当。

以促炎细菌类群增多为特点的肠道菌群紊乱在AD的发病机制中扮演着重要角色。研究发现,变形菌门与免疫反应和炎症相关,其富集会增加患有AD的风险[32]。大肠杆菌-志贺菌属为变形菌门下肠杆菌科的成员,与炎症反应高度相关,其丰度的增加会促进炎性介质的释放,损伤肠屏障和血脑屏障,导致大量病原体和毒素随血流入脑,损伤神经元,造成认知缺陷[33]。副萨特氏菌属、丹毒丝菌属和螺杆菌属均为条件致病菌,可引起宿主持续感染,被证实与AD的外周炎症状态有关[34-35]。肠道某些革兰氏阴性菌(如变形菌、肠杆菌和巴斯德菌等)的过度增殖会促进脂多糖(LPS)的释放[36]。LPS作为强炎症反应诱导物会触发神经炎症并导致更多的淀粉样蛋白沉积和tau蛋白病理学改变,加速AD的病理进程[37-38]。因此,抑制促炎菌的生长可能是减轻AD神经炎症,改善认知功能的潜在靶点。本研究中,模型组小鼠表现出对变形菌门、肠杆菌科、巴斯德菌科、萨特氏菌科、大肠杆菌-志贺菌属、副萨特氏菌属和丹毒丝菌属的显著富集,表明APP/PS1小鼠存在以促炎细菌增多为特点的肠道菌群紊乱,与之前的研究结果一致。针刺和益生菌则显著降低了上述致病菌的丰度,表明针刺在一定程度上能够抑制APP/PS1小鼠体内促炎细菌的增长,纠正肠道菌群紊乱,且与益生菌作用相当。

除促炎菌的增多外,有益菌的减少也与AD的发生发展密切相关。毛螺菌属、瘤胃球菌属和另枝菌属均属于有益菌属,能够参与SCFA的合成[39]。SCFA是沟通肠道与大脑的关键信号分子,可减少小胶质细胞的激活并抑制可溶性Aβ聚集体的形成,发挥抗炎和神经保护作用[40-41]。Muribaculaceae和普雷沃氏菌属均为拟杆菌门成员,能够在大脑神经变性的过程中产生神经保护作用[42]。研究表明,普雷沃氏菌属的比例与AD病理进程呈现负相关趋势[43],Muribaculaceae的相对丰度与APP/PS1小鼠的认知功能呈正相关[44]。拟杆菌属是一种抗炎菌,能够通过修复受损的肠屏障,减轻肠道泄漏引起的外周炎症,进而缓解AD相关症状[45]。因此,AD的治疗可能通过增加有益菌的含量,促进肠道菌群平衡的恢复来实现。本研究发现,模型组小鼠表现出较正常组小鼠低的Muribaculaceae、拟杆菌属、普雷沃氏菌属、另枝菌属和毛螺菌属丰度,说明APP/PS1小鼠存在有益菌减少为特点的肠道菌群紊乱,与之前的结果一致[39]。针刺和益生菌则显著增加了Muribaculaceae的相对丰度,但对拟杆菌属、普雷沃氏菌属、另枝菌属和毛螺菌属没有显著作用,表明针刺可能通过上调与认知相关的有益菌属Muribaculaceae的丰度来提高APP/PS1小鼠的认知能力。此外,COG功能预测显示,与正常组相比,模型组在能量产生和转换、氨基酸转运和代谢、核苷酸转运和代谢、碳水化合物转运和代谢、脂质转运和代谢、辅酶转运和代谢及信号传导等功能上显著上升,针刺和益生菌则显著降低了这些功能的丰度,表明AD的发病进程可能与肠道菌群功能变化存在关系,而针刺可以调节肠道菌群组成结构,进而缓解菌群代谢功能上的紊乱,且作用与益生菌相当。

综上所述,“通督启神”针法能够良性调节APP/PS1小鼠的肠道菌群紊乱,进而提升其学习记忆能力,具体表现为纠正厚壁菌门与拟杆菌门比例失调、下调促炎致病菌的丰度和上调与认知有关的有益菌的丰度并在一定程度上缓解由AD引起的肠道菌群功能紊乱。然而,“通督启神”针法调节肠道菌群进而改善AD认知功能障碍的具体机制仍需要进一步深入研究。