和木化癥汤抗肝癌关键成分及其免疫调节机制的网络药理学分析*

庄丽萍 陈春燕 刘 荣 陈晓蓉 杨宗国

1.复旦大学附属肿瘤医院中西医结合科 (上海, 200032) 2.上海市公共卫生临床中心药学部 3.上海市公共卫生临床中心中西医结合科

原发性肝癌是我国目前第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因,近年来,基于免疫节点抑制剂的联合治疗为中晚期肝癌患者带来了新的曙光,总体客观缓解率为20%～30%[1]。越来越多的研究表明,中医药在肝癌的防治方面展现了其独特的优势,在改善肝癌患者的生存质量、增强免疫力、延长生命等方面有着显著疗效[2,3]。根据肝癌病理变化和临床表现,本病属于中医学“癥瘕”“积聚”范畴,其基本病机为正虚邪盛,瘀阻肝络;邪毒久稽,肝络受损,气滞血瘀。所谓“久病入血”“久病入络”,血络瘀阻为积之体,肝络失和为癥之用,从瘀论治、调和肝络是紧扣其病机关键的治则治法。和木化癥汤是本团队在《金匮要略》下瘀血汤基础上,根据中医辨证理论化裁而成,由大黄、桃仁、虫、柴胡、黄芩、牡蛎组成,用于治疗肝癌患者取得了很好的临床疗效。《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》中推荐使用下瘀血汤治疗血瘀证肝癌患者[4]。下瘀血汤加减治疗原发性肝癌肝热血瘀证行经皮肝动脉化疗栓塞(TACE)术后患者,可有效改善其中医症候,降低血清基质金属蛋白酶水平,改善肝功能及生活质量[5]。体内外实验均表明,下瘀血汤可抑制肝癌细胞增殖,诱导肝癌细胞凋亡[6,7]。然而,下瘀血汤原文主治妇人产后瘀血内停致少腹疼痛,缺乏治疗肝癌的引经药物。柴胡、黄芩为小柴胡汤的关键药对,主治“胁下满痛”。柴胡善疏散少阳半表半里之邪,使邪气外达,解表而和里;黄芩善清肝胆气分之热,使半里之邪内彻,二药可调肝胆之气机,清内蕴之湿热。《汤液本草》中指出“牡蛎,咸为软坚之剂,以柴胡引之,能去胁下之硬”。和木化癥汤以柴胡、黄芩、牡蛎引专治妇人血瘀证之下瘀血汤入肝经,紧扣肝癌之瘀阻血络病机,配伍得当,方证相合,具有较好的潜在研究价值。本研究通过网络药理学方法,从“成分-靶点-通路”角度探讨和木化癥汤抗肝癌的关键成分及其免疫调节机制,为该中药复方的理论研究及临床应用提供思路与依据。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分靶点筛选 通过TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)检索大黄、桃仁、柴胡、黄芩的化合物成分和靶点,成分筛选条件为口服利用度(OB)≥30%,药物类似性(DL)≥0.18。其中,由于TCMSP数据库未收录牡蛎和土鳖虫,因此,二者的化合物成分从Batman-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)进行补充,选取得分>20分的成分靶点纳入。所有靶点经UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)校正,输入蛋白名称并限定物种为“Homo sapiens”,去掉非人类靶点。

1.2 药物-疾病靶点(DDT)网络可视化分析 通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/),NCBI基因数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)以及DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/),以“Liver Cancer”为关键词,检索肝癌相关的人类基因。其中GeneCards数据库所获得的靶点将得分基于中位值进行筛选以获得更加相关的靶点。利用Venny 2.1平台筛选药物靶点与疾病靶点的共同蛋白,所得交集即为DDT。将DDT纳入Cytoscape 3.8.0软件进行DDT的网络可视化分析展示。通过NetworkAnalyzer工具进行拓扑分析。

1.3 蛋白相互作用网络 将药物疾病共有靶点DDT输入STRING数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建,将生物种类设定为“Homo sapiens” ,最低互动分数为0.9。利用Cytoscape 3.8.0软件进行PPI网络可视化。

1.4 关键成分筛选 将药物成分、疾病及作用靶点纳入Cytoscape 3.8.0软件构建成分-疾病-靶点网络图。按照药物成分度值排序,筛选度值大于平均度值的成分为关键成分。

1.5 免疫功能富集分析 将药物疾病共有靶点DDT进行GO生物过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组分(CC)及KEGG信号通路富集分析,引用STRING数据库,将校正P<0.05的项目按照免疫相关关键词进行筛选,具体包括“T cell”“B cell”“Natural killer cell”“Th1”“Th2”“Th17”“Fc”“TNF”“IL-17”“chemokine”“cytokine”“PD-1”及“immune”等。利用imageGP平台将富集结果进行可视化分析[8]。

2 结果

2.1 和木化癥汤关键成分 通过TCMSP及Batman-TCM数据库筛选和木化癥汤组方成分的靶点,经UniProt数据库人类靶点校正,汇总删重后,柴胡获得16个化合物成分,179个靶点;大黄获得16个化合物成分,68个靶点;黄芩获得36个化合物成分,120个靶点;桃仁获得45个化合物成分,50个靶点;牡蛎获得5个化合物成分,27个靶点;土鳖虫获得1个化合物成分,32个靶点。

通过GeneCards、NCBI及DisGeNET数据库检索肝癌靶点。其中GeneCards数据库获得4 230个相关靶点;NCBI数据库获得719个相关靶点;DisGeNET数据库获得1 395个相关靶点。将这3个数据库的基因合并删重之后,得到4 883个肝癌相关基因。

将筛选出的药物靶点与疾病靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1,得到197个共有靶点(图1A)。将共有靶点构建PPI蛋白互作网络,见图2B,该网络中有197个节点,693条边,平均度值为7.07。其中核心靶点为MAPK1、AKT1、HSP90AA1、JUN、RELA、ESR1、FOS、MAPK14、IL6及RXRA等。

图1 和木化癥汤与肝癌的共有靶点及其PPI网络

图2 成分-疾病-靶点网络

2.2 成分-疾病-靶点网络构建及可视化 为了更好理解成分、疾病以及相应靶点之间的复杂作用关系,我们以纳入的成分、治疗疾病以及作用靶点为基础,通过Cytoscape 3.8.0软件构建了成分-疾病-靶点网络图(图2)。

2.3 和木化癥汤关键成分筛选 将成分-疾病-靶点网络图,导入Cytoscape 3.8.0中进行拓扑分析。将成分进行度值的排序,度值越高成分越重要。取大于平均度值(12)的成分作为关键成分(表1)。和木化癥汤与肝癌相关度较大的核心成分是quercetin(槲皮素)、kaempferol(山柰酚)、wogonin(汉黄芩)、baicalein(黄芩素)、isorhamnetin(异鼠李素)及betA-sitosterol(β-谷甾醇)等。

表1 和木化癥汤关键成分基本信息

2.4 GO功能富集 将和木化癥汤和肝癌的197个共有靶点纳入STRING数据库进行GO的BP、MF、CC富集,以校正P<0.05及错误发现率(FDR)<0.05为标准,共得到2 234条生物过程,158项MF相关的注释,64项CC组成相关的注释。通过T cell、B cell关键词筛选,共得到49条BP注释。如图3所示,和木化癥汤主要参与肝癌T细胞及B细胞的活化、增殖、分化、迁移、自稳、凋亡及其调控过程。

2.5 KEGG信号通路 将和木化癥汤和肝癌的197个共有靶点纳入STRING数据库进行KEGG信号通路富集,以校正P<0.05及错误发现率(FDR)<0.05为标准,共得到166条注释。通过免疫关键词筛选,共得到13条KEGG信号通路(图4)。可以看出,和木化癥汤及肝癌的共有靶点主要富集于IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、Th17 cell differ-entiation、Chemokine signaling pathway、T cell receptor signaling pathway等免疫相关信号通路。

图4 和木化癥汤及肝癌共有靶点的KEGG信号通路富集(免疫相关)

3 讨论

在肝癌的发生发展过程中,“郁、湿、热、瘀”是其最主要的病理因素。肝郁气滞是发病的起始,湿、热、瘀胶结是发病的要点[9]。《圣济总录·积聚门》中指出:“牢固推之不移者癥也”。《奇效良方》中关于“积”的成因认为:“气上逆,则六腑不通,但气不行,凝血蕴里不散,津液凝涩不去而成积矣”。《丹溪心法》中指出“气血冲和,百病不生。一有怫郁,诸病生焉,故人身诸病多生于郁”。在肝癌的发生发展过程中,气机郁滞促进了“湿、热、瘀”等病理因素的形成,有形之邪相互胶着,附着于肝络,日久成积[9]。同时,少阳枢机不利是肝癌发生的重要环节[10]。因此,肝癌的治疗应以理气解郁、和解少阳为关键,清热化湿、活血化瘀为要点。和木化癥汤以下瘀血汤为底,加用小柴胡汤中善治少阳的经典药对柴胡、黄芩,辅以牡蛎“结者散之”,软坚散结。下瘀血汤广泛应用于肝硬化、肝癌的治疗[4]。《金匮玉函经二注》曰:“血之干燥凝着者,非润燥荡涤不能去也。芍药、枳实不能治,须用大黄荡逐之,桃仁润燥,缓中破结,虫下血”。简而言之,下瘀血汤中用大黄入血分,荡热逐瘀,推陈致新;桃仁活血化瘀润燥;土鳖虫善攻干血,破结逐瘀。柴胡味辛苦而性微寒,入肝胆经,可疏利气机之郁滞,《神农本草经》言其有“推陈致新”之效;黄芩苦寒,可清泻少阳之湿热。此二药合用,起和解少阳的主导作用,清泄并施,疏利三焦,调达上下,宣通内外[11]。综上,和木化癥汤全方共奏和解少阳、疏利肝郁、祛瘀通络、软坚散结之功效。

我们利用网络药理学方法对和木化癥汤治疗肝癌的作用成分-靶点-通路做了分析,结果发现,该方与肝癌相关度较大的核心成分是quercetin(槲皮素)、kaempferol(山柰酚)、wogonin(汉黄芩)、baicalein(黄芩素)、isorhamnetin(异鼠李素)及beta-sitosterol(β-谷甾醇)等。多项研究表明,槲皮素能显著抑制肝癌细胞增殖,诱导肝癌细胞凋亡,且与肝癌治疗核心靶点有较好的结合能力[12,13]。山奈酚可提高肝癌细胞Caspase-3活性及细胞自噬能力,诱导细胞凋亡[14,15]。

汉黄芩及黄芩素均为黄芩的有效成分,汉黄芩可抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,改变细胞周期,促进细胞凋亡[16,17];黄芩素可调控肝癌细胞糖酵解及谷氨酰胺代谢,抑制微小RNA-130a(miR-130a)诱导的CANP-MMP-9通路激活,抑制肝癌细胞能量代谢及侵袭能力[18,19]。异鼠李素对人肝癌细胞增殖能力有显著抑制作用,可阻滞肝癌细胞周期,诱导细胞凋亡[20]。作为和木化癥汤各组分的共有活性成分,β-谷甾醇对正常肝细胞的生长及凋亡蛋白几乎没有影响,而剂量依赖性地抑制肝癌细胞的生长,通过线粒体途径及膜死亡受体途径诱导肝癌细胞凋亡[21,22]。

肝癌发生机制复杂,其中免疫调节机制成为肝癌治疗的热点及关键点[23,24]。中药可通过调节肝癌患者的免疫功能,对抑制肿瘤生长、防止肿瘤复发转移、提高生命质量、延长生存期等均方面发挥了重要作用[25]。我们的研究结果发现,和木化癥汤治疗肝癌的核心靶点为MAPK1、AKT1、HSP90AA1、JUN、RELA、ESR1、FOS、MAPK14、IL6及RXRA等。其主要参与肝癌T细胞及B细胞的活化、增殖、分化、迁移、自稳、凋亡及其调控过程,并涉及参与IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、Th17 cell differentiation及Chemokine signaling pathway等信号通路。研究表明,肝癌患者外周血中CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值显著低于健康受试者,而调节性T细胞、Th17及Tc17细胞水平显著高于健康受试者[26]。B细胞可识别肿瘤抗原,发生活化,从而促进肿瘤特异性滤泡辅助性CD4+T细胞的增殖和分化,增强抗肿瘤CD8+T细胞反应[27]。B细胞丰度的增加可显著增强T细胞抗肿瘤免疫反应[28]。IL-17、TNF、Th17作为促肿瘤细胞因子,调控炎症反应及免疫反应,促进肝癌发生发展[29-31]。另外,趋化因子信号通路在促肿瘤微环境的建立及肝癌进展中发挥重要作用,可作为抗肝癌药物靶点[32]。因此,和木化癥汤对T细胞、B细胞及免疫相关信号通路的调控可能是其发挥抗肝癌效应的分子机制。

本研究通过网络药理学分析方法,初步探讨了和木化癥汤抗肝癌的有效成分、核心靶点及免疫调节机制,为本复方的基础研究及临床应用提供了一定的思路与依据。虽然利用网络药理学分析中药复方成分-靶点-通路的技术日益成熟,但该方法只作为一般性预测,其结果可靠性仍需要进一步论证。本研究仅局限于公共数据库的生物信息学分析,后续研究应对和木化癥汤抗肝癌活性成分及免疫调节机制进行实验验证。