miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群在原发性肝癌早期诊断及预后评估中的应用价值*

鲁建锋 蔡 莹 徐佳灵

杭州市萧山区第一人民医院 1.感染科 2.呼吸内科 3.肿瘤内科 (浙江 杭州, 311201)

原发性肝癌(PHC)早期症状不典型,诊断难度较大,临床超过80%的PHC患者确诊时即已为中晚期,影响患者生活与预后质量[1]。因此,探寻更加简便、科学、准确的分子标志物以提高PHC的早期筛查诊断准确率是临床研究的热点。微小核糖核酸-934(miR-934)是近年来研究较多的非编码RNA小分子,在人体内广泛分布,有研究指出miR-934在肿瘤发生与发展中发挥了重要作用[2,3]。泛素结合酶UbcH10(UbcH10)是一种具有细胞周期调节作用的蛋白,能够影响有丝分裂的后期转换从而参与肿瘤的发生与进展过程[4,5]。免疫功能异常引起的肿瘤细胞免疫逃逸与肝癌的发生之间关系密切,其中T淋巴细胞亚群(包括CD3+、CD4+、CD8+等)对人体肿瘤细胞的清除发挥着关键作用。近期研究指出肿瘤免疫逃逸机制与T细胞有关[6,7],在恶性肿瘤的诊断、治疗与病情评估中具有较高价值。本研究探讨miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群在PHC早期诊断及预后评估中的应用价值,现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2019年1月至2022年1月我院200例肝部肿瘤患者临床资料,根据患者穿刺活检或手术病理检查结果,肝良性肿瘤患者106例(良性组),肝恶性肿瘤患者94例(PHC组)。纳入标准:①因肝区不适、消化道症状或其他伴随检查发现未经定性的肿块;②均接受miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群检查;③经穿刺活检或手术病理检查最终定性;④临床资料完整清晰;⑤患者对研究知情且自愿参与。排除标准:①合并严重腹部创伤或维生素K缺乏症;②继发性肝肿瘤;③合并消化道活动性感染;④合并严重精神疾病或认知障碍;⑤合并免疫功能缺陷病。本研究经萧山区第一人民医院医学伦理委员会批准,伦理审批号:[2018]伦审批第002号。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-934检测 采集患者外周空腹静脉血样5 ml,以15 cm半径、3 500转/min离心15 min后取上清液,-20℃低温保存备用;采用实时荧光定量PCR 法检测miR-934表达情况,使用总RNA提取试剂盒(北京盒子生工科技有限公司)提取总RNA,使用逆转录试剂盒(美国赛默飞世尔公司)逆转录得到cDNA,以 cDNA为模板进行实时荧光定量PCR 法检测,5 min 94℃、30 s 94℃、35 s 60℃、20 s 72℃反应条件下40个循环,引物由武汉赛培生物科技有限公司合成(miR-934 5′-3′:UGUCUACUACUGGAGACACUGG),采用2-ΔΔCt法计算血清miR-934相对表达量。

1.2.2 肿瘤组织UbcH10检测 所有患者术中或穿刺活检过程中均采集肝肿瘤组织样本一小块,将RNA抽提剂(北京盒子生工科技有限公司)加入100 mg肿瘤组织样本内提取总RNA,使用超微量紫外分光光度计(瑞士METTLER TOLEDO公司,UV5Nano)检测RNA纯度,使用逆转录试剂盒(美国赛默飞世尔公司)逆转录得到cDNA,以 cDNA为模板进行实时荧光定量PCR 法检测,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参,5 min 95℃、1 min 95℃、1 min 60℃、1 min 72℃反应条件下30个循环,UbcH10引物序列由武汉赛培生物科技有限公司设计合成(内参GAPDH 5′-3′:TTGGTATCGTGGAAGGAGTCA;UbcH10 5′-3′:GATAGCAGGGCGTGAGGAAC),采用2-ΔΔCt法计算肿瘤组织的UbcH10相对表达量。

1.2.3 外周血CD3+、CD4+、CD8+检测 采集患者外周空腹静脉血样5 ml,加入2 ml 乙二胺四乙酸(EDTA)混合均匀,吸取10 μl白细胞分化抗原检测试剂(CD3+、CD4+、CD8+,美国赛默飞世尔公司)与100 μl全血混合均匀,37℃避光孵育15 min,然后分别加入溶血素2 ml后重复孵育1次,使用鞘液5 min 1 500转/min清洗2次,重悬细胞后使用流式细胞仪(美国BD Biosciences,FACSCanto Ⅱ)检测CD3+、CD4+、CD8+表达水平。

1.3 观察指标 比较PHC与肝良性肿瘤患者的miR-934、UbcH10、CD3+、CD4+、CD8+表达情况。参考《PHC诊疗规范(2017年版)》标准[8]将PHC分为Ⅰ～Ⅳ期,比较不同分期PHC患者的miR-934、UbcH10、CD3+、CD4+、CD8+表达情况。以穿刺活检或手术病理检查为金标准,分析miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞检测与miR-934+UbcH10+外周血T淋巴细胞亚群联合检测诊断PHC的灵敏度、特异度,建立接受者操作特征(ROC)曲线,分析miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群诊断PHC的效能。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件分析数据,年龄、肿块直径、体质指数、miR-934、UbcH10、CD3+、CD4+、CD8+采用t或F检验,性别、特异度、灵敏度、符合率采用χ2检验,miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞诊断PHC的效能采用ROC曲线分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较 见表1。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 两组患者miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群表达情况比较 见表2。

表2 两组患者miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群表达情况比较

2.3 不同临床分期PHC患者miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群表达情况比较 PHCⅠ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期患者的miR-934、UbcH10、CD3+、CD4+、CD8+差异有统计学意义(P<0.05)。PHCⅢ～Ⅳ期患者的miR-934、UbcH10高于PHCⅠ期、Ⅱ期患者,CD3+、CD4+、CD8+低于PHCⅠ期、Ⅱ期患者(P<0.05);PHCⅡ期患者的miR-934、UbcH10高于PHCⅠ期患者,CD3+、CD4+、CD8+低于PHCⅠ期患者(P<0.05),见表3。

2.4 miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群诊断PHC的结果 miR-934≥30.00(相对表达量2-ΔΔCt表示)视为恶性,反之为良性;UbcH10≥0.30(相对表达量2-ΔΔCt表示)视为恶性,反之为良性;T淋巴细胞亚群中CD3+≤67.00(%)、CD4+≤35.00(%)、CD8+≤24.00(%)视为恶性,反之为良性。miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞诊断PHC的结果见表4。

表4 miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群诊断PHC的结果 (例)

2.5 miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群诊断PHC的效能 见表5。miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群诊断PHC的ROC曲线见图1。

图1 miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞诊断PHC的ROC曲线

表5 miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群诊断PHC的效能

3 讨论

PHC早期症状不典型且无特异性,随着肿瘤生长患者可逐渐出现腹部不适、无故性腹泻、肝区疼痛等症状,易与肝良性肿瘤混淆,漏诊误诊率较高,具有诊断难度大、临床处理棘手、患者预后差、病死率高等特点。随着我国肝癌防控防治工作的总体进展,近10年来肝癌得到了有效控制,肝癌发病率总体趋于稳定[9]。但由于人口基数较大,因此目前我国现存肝癌患者人数仍然比较多。2020年全球最新癌症负担数据[10]显示,我国2020肝癌新发人数位居恶性肿瘤第5位,超过了41万人,总体保持较为稳定的发病趋势,但2020年肝癌致死人数却超过了39万人,与新发人数接近,这提示我国肝癌患者死亡率仍处于较高水平。PHC的早期诊断与病情评估能够帮助临床优化治疗方案,从而控制肿瘤进展速度,减轻患者治疗负担,提高患者生存与预后质量。随着肿瘤病理机制研究的发展与进步,越来越多的分子标志物被应用于肝癌的诊治之中,其中外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+等)、miR-934、UbcH10等分子标志物均与PHC的发生和发展有关,对于PHC的早期筛查、诊断、治疗具有重要意义。但目前临床关于miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群在PHC诊治中的研究多集中于单一指标,关于三者联合检测诊断PHC的研究少见。因此本研究探讨miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群诊断PHC的价值及对患者预后的影响,旨在为PHC诊疗提供参考。

本研究结果显示,PHC患者的血清miR-934与肿瘤组织UbcH10水平高于肝良性肿瘤患者,外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)低于肝良性肿瘤患者,表明良恶性肝肿瘤患者的miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群表达水平具有显著差异,可为PHC的鉴别诊断提供参考。结果还显示,PHCⅢ～Ⅳ期患者的miR-934、UbcH10高于PHCⅠ期、Ⅱ期患者,CD3+、CD4+、CD8+低于PHCⅠ期、Ⅱ期患者,表明miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群表达与PHC临床分期存在关联,临床分期越高、预后越差的PHC患者miR-934等指标异常高/低表达越明显。诊断结果显示,miR-934+UbcH10+外周血T淋巴细胞亚群联合诊断PHC的符合率、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值分别为89.50%、90.43%、87.63%、91.26%,均高于miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群单独诊断,表明miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群联合检测能够提高PHC诊断准确率,为肝肿瘤的筛查、鉴别诊断以及治疗提供更科学的参考依据。可能的影响机制有:① 泛素-蛋白酶体系统是机体蛋白质降解的主要途径,泛素-蛋白酶体系统功能异常通常会导致疾病,临床研究证实神经退行性疾病、心血管疾病、恶性肿瘤的发生发展与泛素-蛋白酶体系统功能异常间存在密切关联[11,12]。UbcH10在肿瘤发生和发展中发挥了重要作用,是泛素结合酶E2家族成员,其参与了泛素介导的蛋白质降解途径,对细胞进展(包括肿瘤细胞与正常细胞)调控和蛋白质动态平衡均发挥了重要调节作用,UbcH10高表达会导致细胞周期蛋白降解异常,导致细胞染色体组的稳定性降低,从而增加肿瘤发生与进展风险[13]。② miR-934是近年研究较多的RNA小分子,2020年《Journal Of Hematology &Oncology》发布了一项关于miR-934对癌症影响的研究成果[14],该研究证实miR-934具有诱导巨噬细胞M2极化,从而促进结直肠癌向肝部转移的作用,其中miR-934介导的巨噬细胞M2极化作用可能在PHC的发生与发展中也发挥了重要影响作用,miR-934表达升高能够增加肝癌细胞的侵袭与转移能力。③金方方等[15]的研究证实微环境机体免疫状态与肝癌发生和发展存在关联;T淋巴细胞亚群是人体内重要的免疫相关细胞,CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞能够促进细胞毒性T淋巴细胞的形成,实现抗病毒与抗肿瘤作用,而T 淋巴细胞功能受损会导致外周血CD3+、CD4+、CD8+表达下降,增加肿瘤细胞免疫逃逸机会,增加PHC发生风险,加快病情进展速度[16]。

综上所述,miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群与PHC发生、发展、预后关系密切,通过miR-934、UbcH10、外周血T淋巴细胞亚群联合检测能够提高PHC诊断准确率,评估PHC患者病情及预后质量,具有临床应用价值。