阻断CXCR2对宫内绒毛膜羊膜炎大鼠胎盘组织NLRP3信号转导及Th1/Th2平衡的影响*

林建丽 李慧 吴小妹 周玉华

(海南医学院第一附属医院产科,海南 海口 570100)

早产是导致大约85%新生儿死亡的主要原因,而宫内感染是诱发早产的原因之一,占全球所有早产病例的40%左右[1]。绒毛膜羊膜炎(Chorioamnionitis,CA)是一种常见的妊娠并发症,是世界范围内早产、死产的主要原因。CA作为一种特异性的宫内感染性疾病,还与胎儿生长发育密切相关,此外,其能增加脑室内出血、脑室周围白质软化、支气管肺发育不良等疾病的发生率[2-5],给个人和家庭造成较大压力,并给社会带来沉重的经济负担。胎盘组织对于胎儿多器官和系统的发育均十分重要,胎盘功能障碍会导致胎儿生长受限、早产、流产以及神经发育异常等[6-7]。已知CA会导致胎盘组织出现炎症反应,炎症细胞和炎症因子均可诱导血管内皮发生损伤,导致胎盘血液灌注不良,这一现象与早期早产密切相关[8]。趋化因子配体1(Chemokine ligand 1,CXCL1)及其同源受体(CXC receptor 2,CXCR2)与CA的病理生理学过程有关,随着宫内炎症加剧而表达上调,此外,胎盘组织内炎症的严重程度与CA中CXCL1水平呈正相关[9]。CXCR2是典型的G蛋白偶联受体,作为特征明确的趋化因子受体之一,显示出强大的嗜中性粒细胞或髓源性抑制细胞趋化性,在不同疾病中参与免疫介导的炎症性病理过程[10-11]。目前,CXCR2被认为是控制发病机制中炎症损伤的潜在药理学靶点。关于CXCR2在CA进程中的作用及机制尚未明确,本研究旨在通过给予孕鼠羊膜腔注射脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导CA模型,观察CXCR2 拮抗剂SB225002对CA的影响并探讨可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康成年SD大鼠,雌性50只,雄性25只,体质量270～310 g,由海南药物研究所有限责任公司[生产许可证号:SCXK(琼)2020-0007]提供,雌鼠和雄鼠分笼饲养。动物房温度保持在22～26 ℃之间,相对湿度为40%～60%,每天照明12 h,按时清洁排泄物,并补充食物,期间所有大鼠均自由摄食、饮水。本研究获得我院伦理委员会审核批准(批准文号:KT20210610188)

1.2 主要材料与试剂 CXCR2拮抗剂SB225002(英国Biorbyt公司),LPS(美国Sigma公司),HE染色试剂盒(北京雷根生物技术公司),Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司),第一链cDNA合成试剂盒(上海生工生物工程公司),荧光定量SYBR®Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒(日本Takakra公司),IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5及IL-10特异性ELISA试剂盒(北京索莱宝科技公司),RIPA裂解液、BCA蛋白测定试剂盒和DAPI染料(上海碧云天生物研究所),高敏型ECL化学发光检测试剂盒(南京诺唯赞生物公司),大鼠外周血淋巴细胞分离液(北京凯诗源生物科技公司),免疫荧光染色试剂(上海晶莱生物公司),兔抗NLRP3单克隆抗体、兔抗ASC多克隆抗体及兔抗Caspase-1多克隆抗体(英国Abcam公司),FITC标记山羊抗兔IgG抗体、FITC标记的CD4抗体、PE-A标记的IFN-γ抗体以及PE-A标记的IL-4抗体(北京百奥莱博科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 实验动物模型制备与分组处理 将雌雄大鼠按2∶1的数目比例进行合笼饲养,记录时间,以发现雌性大鼠阴道栓形成或显微镜下观察到阴道分泌物涂片有大量精子则视为交配成功,记为受孕第1天。将孕鼠单笼饲养,随机选取48只分为4组:对照组、SB225002组、LPS组、LPS+SB225002组,每组12只。LPS组和LPS+SB225002组的孕鼠在受孕第18天时,10%水合氯醛腹腔麻醉,无菌环境下备皮开腹,向孕鼠羊膜腔内分别注射0.5 mg/kg的LPS,对照组和SB225002组的孕鼠同时注射等体积生理盐水;接着给予SB225002组和LPS+SB225002组的孕鼠羊膜腔内注射3 mg/kg的CXCR2拮抗剂SB225002,对照组和LPS组同时注射等体积生理盐水。注射完毕后,将胚胎放回腹腔中,无菌生理盐水冲洗腹腔并分层关闭,监测孕鼠活动、摄食、阴道流血和感染等情况,各孕鼠实验前的体质量无统计学差异。

1.3.2 胎盘组织形态学检查 将各组孕鼠麻醉,剖腹留取胎盘组织,生理盐水清洗后滤纸吸干水分,置入4%多聚甲醛固定24 h,通过梯度酒精脱水与二甲苯透明后,浸蜡包埋,在病理切片机上制备4 μm 厚的组织切片。将切片脱蜡至水,置入苏木精水溶液中染色5 min,在酸水与氨水中进行分色,浸泡数秒钟,流水冲洗,再置入伊红染色液染色2 min,进行脱水、透明,滴加树胶在已透明的组织切片上,晾干,在光学显微镜下观察胎盘组织病理学形态变化并采集图像。每张切片随机选取3个视野,通过Image-Pro Plus软件分析血窦面积,结果取平均值。

1.3.3 免疫荧光染色 取制备的胎盘组织切片,经梯度酒精脱水与二甲苯透明后,放入柠檬酸修复液里微波炉加热煮沸,室温冷却,PBS洗涤,浸入0.3% TritonX-100中孵育处理15 min,滴加10%山羊血清覆盖切片,37 ℃封闭2 h。甩去残液,加入兔抗NLRP3单克隆抗体(1∶200)作为一抗进行标记,4 ℃孵育过夜;次日,甩去残液,PBS洗涤,以FITC标记山羊抗兔IgG(1∶1 000)作为二抗,37 ℃湿盒避光孵育1 h,PBS洗涤后,加入DAPI染料,37 ℃湿盒避光染色10 min,滴加荧光抗淬灭剂封片,晾干,在荧光显微镜下观察各组大鼠胎盘组织内染色情况,并采集图像,每张切片随机取5个视野,计数该视野下NLRP3阳性表达数目,结果取平均值。

1.3.4 实时荧光定量PCR反应 取胎盘组织剪碎并研磨匀浆,Trizol试剂液提取总RNA,按说明步骤操作,经分光光度计检测样品纯度与浓度。根据第一链cDNA合成试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板,在荧光定量PCR系统进行定量扩增,检测目的基因在mRNA上的表达,具体按照SYBR®Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书来配制反应体系,依次加入各试剂和引物,GAPDH基因作为内参。扩增程序设置如下: 95 ℃ 30 s,1个循环;95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,40个循环。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成,具体如下:NLRP3,上游引物5’-CCATCGGCAAGACCAAGA-3’,下游引物5’-ACAGGCTCAGAATGCTCATC-3’; ASC,上游引物5’-AACCCAAGCAAGATGCGGAAG-3’,下游引物5’-TTAGGGCCTGGAGGAGCAAG-3’;Caspase-1,上游引物5’-CAGACAAGGGTGCTGAACAA-3’,下游引物5’-TCGGAATAACGGAGTCAATCA-3’;GAPDH,上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’,下游引物5’-CACCCTGTTGCTGT AGCCAAA-3’,扩增结束后,采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.3.5 Western blot法 取胎盘组织剪碎并研磨匀浆,预冷的RIPA裂解液裂解组织提取总蛋白,BCA法测定浓度。制备10% SDS-PAGE,将上样缓冲液与样本混合,沸水煮10 min使蛋白变性,取等量蛋白样品加入SDS-PAGE胶孔内,经电泳分离蛋白,电转至PVDF膜。制备封闭液,将转好的膜浸入5%脱脂奶粉中封闭2 h,TBST洗膜,加入一抗工作液,4 ℃孵育过夜。次日,TBST洗膜,加入二抗工作液,室温孵育2 h。TBST再次洗膜后,利用ECL试剂显色,在凝胶成像系统下曝光,通过Image-Pro Plus分析软件统计各蛋白条带灰度值,GAPDH蛋白作为内参,以目的蛋白与内参蛋白的灰度值之比作为目的蛋白的相对表达量。

1.3.6 酶联免疫吸附法 各组大鼠眼眶静脉丛采血,样品室温静置2 h,以4 000 r/min离心15 min,获取上清,使用特异性ELISA试剂盒测定各组样本血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5以及IL-10的水平,实验步骤严格按照试剂盒说明书进行,并制作标准曲线,计算各细胞因子的含量。

1.3.7 流式细胞术 采集各组大鼠外周血,将100 μL血液样本与200 μL PBS缓冲液混合,加入大鼠淋巴细胞分离液分离单核细胞,以4 000 rpm离心30 min,吸取上中层交界处含淋巴细胞与单核细胞混合液,继续以4 000 rpm离心30 min,保留沉淀。重悬沉淀,添加FITC标记的CD4抗体,室温避光静置30 min,再使用固定剂与破膜剂处理,分别加入PE-A标记的IFN-γ抗体、PE-A标记的IL-4抗体,室温避光静置30 min,离心后弃上清,PBS缓冲液重悬,通过流式细胞仪检测Th1、Th2细胞比例变化情况,并计算Th1/Th2比值。

2 结果

2.1 各组大鼠胎盘组织病理学形态观察结果 通过HE染色观察各组大鼠胎盘组织形态学,可见对照组大鼠胎盘组织结构正常,血管规则,未见明显的炎症细胞浸润;相较于对照组,SB225002组大鼠胎盘组织未发生明显变化(P>0.05),而LPS组大鼠胎盘组织内蜕膜炎症细胞浸润及绒毛膜炎症程度明显,血管管腔不规则,胎盘血窦面积显著增加(P<0.05),胎盘结构发育受到破坏;与LPS组比较,LPS+SB225002组大鼠胎盘组织内蜕膜炎症细胞浸润减轻,绒毛膜炎症现象也得到改善,胎盘血窦面积显著减小(P<0.05),见图1。

2.2 各组大鼠胎盘组织内NLRP3表达水平比较 通过免疫荧光染色观察各组大鼠胎盘组织内NLRP3表达,图中红色荧光代表NLRP3阳性表达,相较于对照组,SB225002组大鼠胎盘组织内红色荧光强度未发生明显变化,NLRP3阳性表达率变化无显著差异(P>0.05),LPS组大鼠胎盘组织内红色荧光强度明显增强,NLRP3阳性表达率显著升高(P<0.05);而LPS+SB225002组大鼠胎盘组织内红色荧光强度明显减弱,NLRP3阳性表达率显著低于LPS组(P<0.05),见图2。

图2 各组大鼠胎盘组织NLRP3表达检测

2.3 各组大鼠胎盘组织内NLRP3信号转导途径相关基因及蛋白表达水平比较 实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照组比较,SB225002组大鼠胎盘组织内NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA相对表达量变化无显著差异(P>0.05),LPS组大鼠胎盘组织内NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA相对表达量均显著上调(P<0.05);与LPS组比较,LPS+SB225002组大鼠胎盘组织内NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA相对表达量均显著下调(P<0.05)(图3)。Western blot检测结果显示,SB225002组大鼠胎盘组织内NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白相对表达量与对照组之间均无显著差异(P>0.05),而LPS组大鼠胎盘组织内NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白相对表达量均显著高于对照组(P<0.05);与LPS组比较,LPS+SB225002组大鼠胎盘组织内NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白相对表达量均显著下调(P<0.05),见图4。

图3 各组大鼠胎盘组织NLRP3、ASC及Caspase-1 mRNA表达水平比较

图4 各组大鼠胎盘组织NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表达水平比较

2.4 各组大鼠血清炎性因子水平比较 ELISA检测各组大鼠血清内IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5及IL-10水平结果显示,与对照组比较,SB225002组大鼠血清内IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5及IL-10水平变化均无显著差异(P>0.05),LPS组大鼠血清IL-2、IFN-γ水平显著升高,IL-4、IL-5及IL-10水平显著降低(P<0.05);与LPS组比较,LPS+SB225002组大鼠血清IL-2、IFN-γ水平显著降低,而IL-4、IL-5及IL-10水平均显著升高(P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠血清细胞分泌因子水平比较

2.5 各组大鼠外周血Th1/Th2细胞比例分布比较 流式细胞术检测结果显示,与对照组比较,SB225002组大鼠外周血Th1细胞比例、Th2细胞比例及Th1/Th2比值变化均无显著差异(P>0.05),LPS组大鼠外周血Th1细胞比例和Th1/Th2比值均显著升高,Th2细胞比例显著降低(P<0.05);与LPS组比较,LPS+SB225002组大鼠外周血Th1细胞比例和Th1/Th2比值均显著降低,Th2细胞比例显著升高(P<0.05),见图5。

图5 各组大鼠外周血Th1/Th2细胞比例分布

3 讨论

CA主要表现为母体发热、白细胞增多、心动过速、子宫压痛以及胎膜早破等,临床CA的诊断最常在临产或足月分娩时进行。CA可引起胎儿炎症反应综合征,这是由于胎儿免疫系统被激活后释放了大量炎症因子,这些炎症因子会干扰胎儿脑细胞因子的正常表达,导致早产儿脑损伤[12]。也有一些临床前研究表明,CA引起的胎儿肺上皮损伤导致血管渗透压受损和细胞凋亡,使肺泡壁变薄,此外,炎症因子也会损伤胎儿肺毛细血管内皮细胞,使得肺泡及血管结构受损,最终引起支气管肺发育不良[13-14]。LPS是革兰氏阴性菌致炎的主要成分,用于建立妊娠相关的炎症性疾病模型,本研究采用孕鼠羊膜腔注射LPS诱导构建宫内CA模型,探讨了使用SB225002阻断CXCR2可对CA胎盘组织损伤起到明显的改善作用,为CA的临床诊疗提供新思路。

CXCR2作为一种在嗜中性粒细胞中表达的趋化因子受体,在癌症和各种炎症或免疫疾病中都起着至关重要的作用,阻断CXCR2是多种疾病治疗的潜在新途径。Saintigny等[15]研究表明CXCR2的表达水平与肺癌的侵袭和转移有关,肺癌细胞中CXCR2高表达与临床患者的预后不良有关,抑制 CXCR2 及其配体CXCL8可显著抑制肺癌细胞的增殖和迁移,并减少肿瘤血管生成。Zhu等[16]研究指出在活动性溃疡性结肠炎患者的结肠黏膜组织和外周血细胞中CXCR2的表达显著增加,CXCR2在中性粒细胞中也高表达,并与疾病活动度呈正相关,用SB225002阻断CXCR2可以显著改善DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎,并降低了中性粒细胞中促炎介质的产生,该研究表明了CXCR2通过调节中性粒细胞的免疫反应在溃疡性结肠炎的发病机制中起关键作用。Sharma等[17]研究表明CXCR2在乳腺癌骨转移过程中调节破骨细胞活化,利用Cl66-shCXCR2敲低乳腺癌细胞中CXCR2表达并植入雌性Balb/c小鼠颅骨背侧皮瓣上后发现肿瘤生长和肿瘤诱导的骨溶解显著减少,同时,观察到注射乳腺癌Cl66-Luc细胞的CXCR2-/-小鼠骨骼中的骨破坏和转移也较野生型小鼠中明显减少。Nie等[18]研究发现在血管紧张素II诱导的腹主动脉瘤组织中的CXCR2表达增加,利用SB265610阻断CXCR2可减轻腹主动脉瘤中胶原沉积、弹性蛋白降解、金属基质金属蛋白酶表达以及巨噬细胞积累,从而降低腹主动脉瘤的形成。在本研究中,通过SB225002阻断CXCR2后CA大鼠胎盘组织内蜕膜炎症细胞浸润和绒毛膜炎症现象减轻,胎盘血窦面积也减小,由此推测,CXCR2可能在CA的发病机制中起着重要作用。

NLRP3炎性体可作为多种炎性疾病的潜在治疗靶点。在羊膜腔感染或炎症下,绒毛膜羊膜中NLRP3炎性体激活与自发性早产有关,此外,在患有CA的自发性早产妇女的胎膜组织中也已检测到炎症小体相关基因NLRP3和Caspase-1的表达上调,同时表明了抑制NLRP3炎性体可延长妊娠期,不仅可以将CA诱发的早产率降低30%,而且还可以显著提高新生儿存活率[19]。奇异变形杆菌、阴道加德纳菌和B族链球菌是羊膜腔内感染常见的微生物,可诱导巨噬细胞中NLRP3炎性体激活[20-22],这进一步暗示该途径与导致早产的机制有关,阻断NLRP3炎性体激活可作为相关疾病的治疗方案。本研究结果显示,利用SB225002阻断CXCR2后发现CA大鼠胎盘组织内NLRP3表达的荧光强度明显减弱,NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著下调,说明阻断CXCR2抑制了NLRP3途径的激活,这可能是其在CA中发挥保护作用的途径之一。

在CA中各种交联免疫因素从而导致患者的适应性免疫系统被激活,各细胞因子分泌及释放的变化可能会改变T细胞发育以促进T辅助细胞效应反应的发展[23-25]。母体与胎儿间的免疫相容是妊娠成功的必备条件,其中Th1/Th2细胞极性的调节是保证胎儿健康生长的关键。已知CA孕妇外周血中Th1细胞分泌因子IL-2、TNF-ɑ及IFN-γ水平均升高,而Th2细胞分泌因子IL-4和IL-6水平降低,说明Th1/Th2细胞极性状态向Th1偏移,Thl/Th2平衡状态被打破[26]。本研究同样显示,CA大鼠血清IL-2、IFN-γ水平显著升高,IL-4、IL-5及IL-10水平显著降低,外周血Th1细胞比例和Th1/Th2比值均显著升高,Th2细胞比例显著降低;而在CXCR2阻断剂SB225002作用下,CA大鼠血清IL-2、IFN-γ水平表现为降低,IL-4、IL-5及IL-10水平均表现为升高,同时,外周血Th1细胞比例和Th1/Th2比值均显著降低且Th2细胞比例显著升高,由此推测,阻断CXCR2参与调控CA中Th1/Th2失衡现象,抑制了Th1/Th2向Th1偏移。

4 结论

CXCR2可能参与了孕鼠CA进程,阻断CXCR2可通过抑制NLRP3信号转导途径及调控Th1/Th2趋于平衡状态,从而对CA孕鼠起到一定的保护作用。由于受到产前产后诸多因素的干扰,CA在妊娠中多发,对母婴结局造成了不良影响,本研究通过构建CA孕鼠大鼠模型并给予CXCR2拮抗剂SB225002处理后,取得了良好的实验效果,这为CA的治疗提供了提供理论依据与实验支持。但也存在一定不足,需进一步从新生幼鼠角度进行相关功能检测,并深入探究相关的调控机制,以期为临床上治疗CA提供新思路。