四味生精口服液治疗肾阳虚模型大鼠实验研究

郭丁禹，肖井雷

（长春中医药大学，长春 130117）

随着现在生活节奏的加快和工作压力的增加，肾虚患者人数日趋增多，治疗药物市场需求规模较大。现治疗药物主要分中、西药两大类，西药主要为激素类，起效快但治标不治本；中药与西药相比虽然起效慢，但在中医理论指导下，能全面调理人体阴阳平衡达到治愈病症的目的，且副作用小，因此治疗此类病症的中成药一直深受病患的认可。本研究通过现代医学指标检测，从激素水平、脏器系数以及组织形态学等方面验证了药物的治疗作用，为推动中医症候研究向现代化迈进贡献了绵薄之力。

1 材料与方法

1.1 实验动物

见表1。

表1 实验动物信息表

1.2 药品

四味生精口服液（生产企业：浙江康恩贝制药股份有限公司）；金匮肾气丸（生产企业：北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号：20030131）。

1.3 仪器试剂

见表2。

表2 仪器试剂表

1.4 给药

见表3。

表3 给药信息表

1.5 剂量设计

1）金匮肾气丸：每日摄入量为50粒，按70 kg人和200 g大鼠等效剂量折算指数法可得，大鼠等效剂量为50×0.018×5 = 4.5粒·kg-1·d-1；2）四味生精口服液：日服剂量为10 mL，按70 kg人和200 g大鼠等效剂量折算指数法可得，大鼠等效剂量为10×0.018×5 = 0.9 mL·kg-1·d-1。各组给药剂量见表4。

表4 剂量设计表

1.6 实验方法

1.6.1 模型建立[1]选择糖皮质激素肌肉注射建立大鼠肾阳虚模型，除空白对照组后肢交替肌肉注射生理盐水外，其余各组均后肢交替肌注氢化可的松25 mg·kg-1·d-1，连续造模14 d。

1.6.2 给药分组 造模14 d后分组：空白对照组、模型对照组、阳性对照组（金匮肾气丸）、四味生精口服液高、中、低剂量组，共6组。第3周起，按10 mL·kg-1灌胃给药，空白对照组、模型对照组灌胃给予等体积蒸馏水，每天1次，连续给药14 d。

1.6.3 指标检测[2-5]末次给药后，将大鼠按体质量腹腔注射10%水合氯醛10 mL·kg-1麻醉。1）腹主动脉取血，3 000 rpm·min-1离心10 min分离血清，采用ELISA检测试剂盒检测血清睾酮（T）与雌二醇（E2）水平；2）取睾丸、前列腺、附睾称重，计算脏器指数；3）取附睾置于5 mL生理盐水中，剪碎，用4层擦镜纸过滤，取滤液1 mL，加9 mL生理盐水，制备精子悬液，将精子悬液在37℃水浴中孵育20 min，备用。取1滴精子悬液滴到细胞计数板上，于显微镜下计数各方格的精子数，将精子数换算为1 mL悬液中所含精子总数。取1滴精子悬液，加入1滴精子活体染色试剂盒染液于载玻片一端，混匀；制成抹片，镜下检查，活的精子头部为无色透明，死亡精子变为粉红色。观察200个精子，计数活精子数，计算精子存活率。

1.6.4 病理检测 末次给药后，将大鼠按体质量腹腔注射10%水合氯醛10 mL·kg-1麻醉。取睾丸，采用10%甲醛固定，常规脱水处理、石蜡包埋、切片，HE染色后光镜观察。采用NIS-ELEMNT BR型图像分析系统400倍镜下测量生精小管上皮细胞层高度（μm）和生精小管横截面中生精细胞所占的面积（μm2），统计比较各给药组中药物对睾丸生精细胞分化状态的改善作用。

1.7 统计学方法

实验数据用SPSS 19.0软件与试剂盒配套数据分析软件统计分析，结果用均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 各组血清睾酮（T）与雌二醇（E2）水平比较

见表5。

表5 各组血清睾酮（T）与雌二醇（E2）水平比较（±s，n= 10）

注：与空白对照组比较，### P＜0.001；与模型对照组比较，△△△P＜0.001

组别剂量/（mL·kg-1）T/（nmol·L-1）E2/（ng·L-1）空白对照组—37.56±8.95 35.93±9.79模型对照组—17.95±8.44###112.42±40.06###阳性对照组4.5粒/kg32.86±4.34△△△ 33.89±10.24△△△四味生精口服液高剂量组3.636.92±6.56△△△ 35.65±8.31△△△四味生精口服液中剂量组1.831.18±8.05△△△ 36.74±8.66△△△四味生精口服液低剂量组0.932.16±6.73△△△ 30.18±7.30△△△

2.2 各组睾丸、附睾、前列腺脏器指数比较

与空白对照组比较，模型对照组睾丸、附睾、前列腺脏器系数均无明显差异（P＞0.05）。与模型对照组比较，各给药组睾丸、附睾、前列腺脏器系数均无明显差异（P＞0.05）。

2.3 各组精子总数与精子存活率比较

见表6。

表6 各组精子总数与精子存活率比较（±s，n= 10）

表6 各组精子总数与精子存活率比较（±s，n= 10）

注：与空白对照组比较，## P＜0.01，### P＜0.001；与模型对照组比较，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

组别剂量/（mL·kg-1）精子总数（106）精子存活率/%空白对照组—5.47±1.2591.62±3.78模型对照组—3.48±0.85##27.17±2.91###阳性对照组4.5粒/kg5.44±0.77△△78.83±6.34△△△四味生精口服液高剂量组3.65.55±0.60△△△83.93±5.65△△△四味生精口服液中剂量组1.85.46±0.46△△△87.39±5.86△△△四味生精口服液低剂量组0.95.25±0.44△△88.03±3.04△△△

2.4 各组病理检测结果

1）空白对照组：睾丸生精小管中各级生精细胞排列规整，生精小管结构正常。大鼠生精小管饱满，结构完整，小管内生精上皮层数清晰完整，各级生精细胞排列整齐有序，管腔内可见大量成形的精子细胞。2）模型对照组：睾丸生精小管中生精细胞排列紊乱、上皮变薄，大部分管腔内可见脱落的精子细胞，少数可见精母细胞脱落；且可见到生精细胞分化成熟过程受阻。3）各给药组：睾丸组织结构趋向正常，生精小管中各级生精细胞排列基本规整，生精小管结构基本正常；生精小管萎缩和生精小管上皮变薄的现象有显著的改善作用；具有改善和促进睾丸生精的作用，改善生精细胞向精子形成的分化过程，促进精子细胞的成熟过程。见图1。

图1 睾丸组织病理切片结果

2.5 各组睾丸形态测量结果比较

见表7。

表7 各组睾丸形态测量结果比较（±s，n= 10）

表7 各组睾丸形态测量结果比较（±s，n= 10）

注：与空白对照组比较，## P＜0.01，### P＜0.001；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

组别剂量/（mL·kg-1）生精小管上皮细胞层高度/μm生精小管横截面中生精细胞所占面积/μm2空白对照组—75.128±12.31143 916.112±10 859.114模型对照组—54.746±8.935##20 671.362±3 117.232###阳性对照组4.5粒/kg64.634±8.666△34 813.560±9 837.763△△四味生精口服液高剂量组3.668.542±11.377△△42 346.034±8 096.353△△△四味生精口服液中剂量组1.865.791±12.175△33 253.611±10 083.127△△四味生精口服液低剂量组0.966.306±11.711△33 037.434±9 112.934△△

3 讨论

中医认为肾为命门所附，为先天之本，与人的生长发育生殖排泄有着极其密切的关系，因其只宜固藏，不宜泄露，所以肾病多虚证。肾虚包括阴、阳、气、精的亏损。肾虚以肾阴虚和肾阳虚为主。阴虚包括肾阴亏虚和阴虚火旺，阳虚包括肾气不固，肾不纳气，肾阳不振，肾虚水泛[6]。糖皮质激素注射是肾虚模型较常用的造模方法，本实验中采用氢化可的松肌肉注射复制大鼠肾阳虚模型，造模后动物出现状态萎靡、弓腰、毛发蓬松等现象，且病理检测结果显示，模型对照组大鼠睾丸中生精细胞层厚度与生精细胞所占面积明显减少（P＜0.01，P＜0.001），说明模型复制成功。

睾酮（T）又称睾丸素、睾丸酮、睾甾酮，是男性最重要的雄激素，男性睾酮全部在睾丸间质细胞线粒体内合成。具有促进和维持生殖器官以及第二性征的发育和生长，维持前列腺和储精囊等器官功能的作用。同时，睾酮可促进蛋白质合成，促进骨骼生长及红细胞生成的作用。雌二醇（E2）是一种甾体雌激素，温特斯坦纳等[7]曾从妊娠马尿中提取出来，此外也可从妊妇尿、人胎盘、猪卵巢等中获得，因为它有很强的性激素作用，所以认为它或它的酯实际上是卵巢分泌的最重要的性激素。

本实验结果显示与模型对照组比较，各给药组T含量均明显升高，且具有统计学意义（P＜0.001）；E2含量均明显降低，且具有统计学意义（P＜0.001）；各组均精子总数均明显升高（P＜0.01，P＜0.001）；各组精子存活率均有明显升高（P＜0.001）；各给药组均可以明显增加模型大鼠睾丸生精小管上皮厚度与生精细胞横截面积（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

综上所述，四味生精口服液可改善肾阳虚模型大鼠血清性激素水平，并可有效提高大鼠精子存活率，可改善模型大鼠睾丸组织中生精小管上皮细胞的生精状态，保护睾丸生精细胞，促进生精细胞分化进程，促进精子生成，表明其对肾阳虚大鼠具有较好的治疗作用。