百令胶囊辅助治疗慢性阻塞性肺疾病患者的免疫生物标记物水平变化分析

黄惠敏，胡海圣，蔡传旭，郑佩燕，方艳婷，孙宝清

（1.广州医科大学附属第一医院检验科，国家呼吸医学中心，国家呼吸系统疾病临床医学研究中心，广州呼吸健康研究院，呼吸疾病国家重点实验室，广州 510120；2.深圳人民医院检验科，深圳 518020）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种以气流受限为特点的常见呼吸系统疾病［1-2］，其特点是持续的气道阻塞性和气道炎症。COPD患者机体存在氧化/抗氧化系统失衡以及气道非特异炎症反应加重。COPD 的反复急性加重导致患者肺功能和生活质量下降、甚至死亡，给家庭和社会带来了沉重的负担。

COPD的患病率在5%以上［3-4］，死亡率在美国排名第3位，每年造成120，000多人死亡［5］。随着我国人口老龄化的不断加剧，COPD 在我国的发病趋势上升，成为目前主要的慢性呼吸系统疾病之一，多数患者伴有不同程度的肺功能损伤，甚至呼吸衰竭［6］。中国成人肺部健康研究发现，我国COPD 患者已经高达1 亿人，40 岁以上人群患病率13.7%，短短十余年间（2002-2015）患病率激增67%［7］。同时，COPD 病程长，患者频繁就诊、常因急性加重而住院，并需要长期治疗（如辅助供氧治疗、药物治疗），因此使用了大量医疗资源。研究显示，中重度COPD 患者的免疫功能低下是导致其急性发作的重要原因，提高患者免疫功能可以控制患者病情的发展，减少急性发作的次数和减轻发作时的症状。

中医学认为冬虫夏草为补益药，可补肺气以助其宣降，助肾阳以渔肾纳气，滋肺肾之阴以降上炎虚火。百令胶囊是发酵虫草菌粉，研究显示百令胶囊有抗炎、抗氧化及双向免疫调节作用，具有补肺益肾、增强机体免疫力、止咳化痰和舒张肺支气管平滑肌的作用，逐渐应用于临床治疗慢性呼吸系统疾病［8-10］。

评估呼吸系统疾病的免疫功能主要集中在两个方面：一是炎症反应的程度和特征；二是免疫细胞的活性和功能状态。在COPD 患者中，持续的肺部炎症是其显著特征之一，这种炎症涉及许多炎症细胞、细胞因子以及炎性介质的参与。研究发现，COPD 与某些MMP 亚型的活性异常存在关联［11-12］，这些异常可能与气道重塑和肺实质破坏有关。此外，SAA 是一种急相蛋白，其水平在COPD 急性加重期常常升高，可作为炎症活动的指标之一。SPD 是肺表面活性物质的重要组成部分，它们在肺的局部防御和免疫调节中起到关键作用。SPD不仅能增强固有免疫细胞对病原体的清除能力，还能调节细胞因子的产生和炎症反应的程度。这些特性使得SPD成为评估肺部免疫功能的重要指标［13］。此外，NE、PRG4 和LTB4 作为COPD 的生物标记物均有研究报道［14-16］。在COPD 患者疾病进展过程中，多种细胞因子的水平发生改变。IL-4、IL-6、IL-8、IL-1β 和GM-CSF的变化与COPD 的炎症过程、气道损伤和免疫调节有关，这些细胞因子可以吸引和激活炎症细胞，加剧炎症反应［17-19］。

目前我国关于百令胶囊长期治疗COPD 患者的免疫功能改变的研究较少。本研究旨在观察长期应用百令胶囊治疗稳定期的中重度COPD 患者，评价百令胶囊对COPD 患者的免疫功能改善情况，监测免疫学指标水平的变化，从而评估百令胶囊对COPD患者的免疫功能改善情况。

1 资料与方法

1.1 伦理批准

本研究经广州医科大学附属第一医院伦理委员会审查批准，批准文号：GYFYY-2016-20。

1.2 研究对象

本研究为双盲平行对照试验，随机入组120 例COPD 稳定期中重度患者，并分为60 例试验组，60例对照组。对照组和试验组因患者未按规定时间复诊各脱落17 例和14 例，最终对照组完成研究43例，试验组完成研究46例，合计89例。

1.3 试验时间与研究终点

项目试验流程包括：筛选期1 周，治疗期1 年（52 周），安全性随访4 周。患者接受满52 周的分组干预后完成试验流程。

1.4 入选标准

（1）年龄：40～80岁，男、女不限。

（2）GOLD III-VI 级COPD：吸入沙丁胺醇400 μg后20分钟测定，FEV1/FVC<70%且FEV1值≤50%预计值。COPD的诊断基于GOLD指南［20］。

（3）病人处于稳定期，即近4周内无COPD 急性加重。

（4）能够进行语言或文字交流，同意参加本研究并签署知情同意书，有能力完成试验相关的检查。

1.5 排除标准

（1）除COPD外的重大疾病。

（2）实验室检查值显著异常。

（3）临床诊断肺癌、支气管扩张症、尘肺或其它单纯的限制性通气功能障碍。

（4）有哮喘史、过敏性鼻炎史、或4 周内血嗜酸粒细胞计数≥600/mm3（0.6×109/L）的患者。

（5）现患有活动性肺结核。

（6）有危及生命的肺栓塞、或α1-抗胰蛋白酶缺乏、或囊性纤维化的病人。

（7）曾进行肺切除术的患者。

（8）妊娠、哺乳或有怀孕可能的妇女。

1.6 分组干预

试验组：常规COPD 药物治疗，口服百令胶囊，每日三次，每次6 粒；连续使用52 周。百令胶囊：每粒装0.5克，由杭州中美华东制药有限公司生产。

对照组：常规COPD 药物治疗，口服百令胶囊模拟剂，每日三次，每次6 粒；连续使用52周。模拟剂外观、气味与百令胶囊一样，由杭州中美华东制药有限公司生产及提供。

为保证随机双盲法实施，对试验用药进行包装，并由专人核对，包装过程有记录。并使用统一标签，外观一致。

1.7 合并用药与治疗

COPD 急性加重，可以统一按照GOLD 指南用药治疗，一般不超过2 周。

1.8 样本采集及分离

在治疗前（V1）和52 周停药时（V6）用紫头管（内含EDTA 抗凝剂）采集患者静脉血2 ml，室温放置至血浆析出后1000×g离心10 分钟后，取上层血浆，放-20 ℃保存，以备检测。

1.9 血液免疫学指标检测

用 ELISA 方 法（DRG Instruments GmbH，Germany）检测血浆中基质金属蛋白酶8（MMP8）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、表面活性物质蛋白-D（SPD）、去甲肾上腺素（NE）、白三烯B4（LTB4）、血清淀粉样蛋白A（SAA）和蛋白聚糖4（PRG4）的水平。并用Meso Scale Discovery（MSD）电化学发光法检测下列细胞因子：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素1β（IL-1β）、白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）和白介素8（IL-8）。

1.10 统计学分析

使用SPSS 19.0 进行统计学处理。正态分布数据以进行描述，非参数定量数据以中位数（四分位数间距）来进行描述，两组间非配对计量资料差异采用Mann-WhitneyU检验，配对计量资料差异采用Wilcoxon检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者的基本情况

入组的患者中，男性85 例，女性4 例，年龄38～79岁，平均年龄（63.1±7.6）岁。对照组中男性41例，女性2 例，年龄41～79 岁，平均年龄（64.7±7.2）岁；试验组中男性44 例，女性2 例，年龄38～77 岁，平均年龄（61.6±7.7）岁。试验组与对照组在年龄和性别分布上没有统计学差异（P>0.05）。

2.2 治疗前后两组患者MMP8、MMP9、SPD、NE、LTB4、PRG4和SAA水平的比较

治疗前，试验组与对照组间MMP8、MMP9、SPD、NE、LTB4和SAA 水平无统计学差异（P>0.05），但对照组的PRG4 水平高于试验组［58.9（38.4，69.6）vs 46.6（28.3，58.0），Z=-2.123，P=0.034］；治疗后，试验组与对照组间MMP8、MMP9、NE、LTB4、PRG4 和SAA 水平均没有统计学差异（P>0.05），但试验组SPD 水平高于对照组［7.9（5.6，18.1）vs 5.0（3.1，14.0），Z=-2.356，P=0.018］、如图1所示。

图1 治疗前后试验组和对照组COPD患者各项生物标记物水平比较

与治疗前相比，试验组的MMP8［717.5（433.6，1366.1）ng/ml vs 384.2（198.3，717.5）ng/ml］和SAA［90.1（56.7，132.4）ng/ml vs 45.1（38.6，57.1）ng/ml］水平均有所下降，差异有统计学意义（Z=-3.428，P<0.05；Z=17.305，P<0.05），但在对照组中，MMP8 和SAA 在治疗前后没有统计学差异（P>0.05）。MMP9、SPD、NE、LTB4 和PRG4 在试验组和对照组中，治疗前后水平变化均没有统计学差异（P>0.05），如表1所示。

表1 治疗前后试验组和对照组COPD患者各项生物标记物水平变化

2.2 治疗前后两组患者细胞因子GM-CSF、IL-1β、IL-4、IL-6和IL-8水平的比较

治疗前及治疗后，试验组与对照组间GM-CSF、IL-1β、IL-4、IL-6 和IL-8 水平均没有统计学差异（P>0.05），如图2所示。

图2 治疗前后试验组和对照组COPD患者各项细胞因子水平比较

治疗后，试验组和对照组的IL-8 均有所下降，差异有统计学意义（Z=-4.612，P=0.000 和Z=-3.027，P=0.002）；试验组GM-CSF 水平治疗后有所上升，差异有统计学差异（Z=-2.715，P=0.007），对照组治疗前后的水平没有统计学差异（P>0.05）。IL-1β、IL-4和IL-6在试验组和对照组中，治疗前后水平变化没有统计学差异（P>0.05），如表2所示。

表2 治疗前后试验组和对照组COPD患者细胞因子水平变化

3 讨论

COPD 的发病机制复杂，至今尚未完全阐明，而多种免疫调节失衡在COPD 的发生、发展中发挥着重要作用。临床研究发现，约70%的COPD 患者存在某些反映系统性炎性反应标记物的异常，约16%的COPD 患者存在持续性系统性炎性反应［21］。根据《慢性阻塞性肺疾病免疫调节治疗专家共识》，中医药复方及虫草制剂或可通过调节机体免疫功能、提高免疫细胞活性改善COPD 稳定期患者生活质量，减少急性加重［22］。

本研究采用百令胶囊辅助治疗稳定期COPD 患者基于其抗炎、抗氧化和调节免疫的作用。中医学认为，COPD 属肺气不宣，肺肾阴虚所致上炎虚火，而百令胶囊是发酵虫草菌粉，其主要活性成分为D-甘露醇和虫草酸，具有补肺益肾、滋阴化火、抗炎平喘、增强免疫力的功效。试验组经过百令胶囊辅助治疗后，患者的MMP8和SAA水平均下降，但对照组中，治疗前后MMP8 和SAA 水平没有差异。基质金属蛋白酶（MMPS）是调节细胞基质组成的主要酶类，是一种锌依赖性内肽酶，能够切割一种或几种细胞外基质成分以及非基质蛋白。MMPS 参与许多与COPD 相关的过程，包括生长因子、细胞因子和趋化因子活性调节；炎症细胞迁移；细胞外基质更新及组织重塑。MMP8是一种存在于大多数哺乳动物结缔组织中的胶原裂解酶，主要由中性粒细胞产生，储存在细胞内颗粒中，活化的MMP8可裂解天然蛋白如纤连蛋白、软骨蛋白聚糖、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白和多肽，与气道损伤有关。此外，多项研究显示，MMP8 与患者特应性水平有关［23-25］，本研究中，试验组治疗后的MMP8水平比治疗前低，这意味着百令胶囊或能通过降低COPD 患者MMP8 水平，降低COPD 患者特应性引起急性发作的风险，但需要进一步研究。SAA 是一种急性相蛋白并与血浆高密度脂蛋白（HDL）结合，由肝细胞产生并分泌到血清中，当机体发生感染或损伤时，可在4-6小时内迅速升高，是反映气道炎症的重要指标。本研究中，试验组经过治疗后，SAA 的水平有所下降，差异有统计学意义（P<0.05），但对照组在治疗前后没有统计学差异。MMP8和SAA 的水平变化提示百令胶囊能在常规治疗的基础上调节COPD 患者免疫生物标记物水平，从而减轻COPD患者的气道炎症。

SPD 属于钙依赖性的胶原凝集素家族成员之一，主要在肺泡Ⅱ型上皮细胞或无纤毛细支气管上皮细胞内合成和分泌［26］。在COPD 患者中，由于炎症和气流受限，肺部的结构和功能发生了变化。由于炎症和气流受限导致肺部破坏，影响了SPD 的产生和功能。降低的SPD 水平可能导致肺泡表面张力增加，使肺泡更容易塌陷，增加呼吸困难和肺功能下降的风险。研究发现，治疗后试验组和对照组的SPD 均有所下降，虽然试验组和对照组治疗前后水平没有统计学差异，但在治疗后，试验组的SPD水平高于对照组，说明在一定程度上，百令胶囊能减少或减缓SPD 的下降。PRG4（Proteoglycan 4）是一种蛋白质聚糖复合物，也被称为超大型蛋白质4或润滑蛋白。COPD 患者的气道和肺组织可能出现PRG4 表达的减少。这种减少可能与气道黏液清除能力下降、气道阻塞和炎症加重有关。在本研究中，对照组的PRG4 水平高于试验组（P<0.05）。但治疗后，试验组和对照组间没有统计学差异。试验组和对照组治疗前后的水平变化也没有统计学差异。PRG4可能是COPD 严重程度的生物标记物，与COPD 患者1 年的最大肺活量下降有关［27］，但关于COPD 患者的PRG4水平目前了解有限，因为研究还在进行中，尚未形成一致的结论。

本研究中，无论是试验组还是对照组，治疗后患者的IL-8 水平均有所下降，IL-8 属于与血小板因子4 有相似结构的小细胞因子家族，由暴露于炎症刺激（如IL-1 或肿瘤坏死因子）的吞噬细胞和间充质细胞产生，并激活中性粒细胞，诱导趋化、胞吐和呼吸爆发，是Th1 型免疫中的关键因子。刘笑然［28］等探讨百令胶囊对稳定期COPD 患者影响，结果发现患病组血清IL 8 的水平较对照组高，治疗后IL-8水平明显下降，与本文研究结果一致。促炎性细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α 等促进COPD 气道炎症的进展，评估细胞因子水平变化，可评估COPD 的病情进展、转归和药效监测。GM-CSF 是一种由多种细胞产生的蛋白质，包括T 淋巴细胞、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等。GM-CSF 的主要作用是促进骨髓干细胞的分化和成熟，促进粒细胞和巨噬细胞的增生和分化。因此，GM-CSF 对于身体免疫防御具有重要的作用。但GM-CSF 的异常表达会导致过度的炎症、疼痛和组织损伤，并促进其他炎症细胞因子的产生［29］。GM-CSF 被认为是哮喘和COPD 发病机制中的重要介质，GM-CSF 在COPD 患者的痰和支气管黏膜中表达增加［30］。本研究中，试验组的GMCSF 水平在治疗后反而上升，与刘笑然［28］等人的研究结果相反，有可能是因为本研究入选的患者均处于稳定期，GM-CSF 处于低水平状态，还没达到过度表达的水平。

综上所述，百令胶囊辅助治疗能改变COPD 患者免疫生物标记物水平，在一定程度上减轻COPD患者气道炎症。我们需要进一步提高对COPD 免疫发病机制的认识，发现新的免疫调节治疗靶点。