EGCG 和异鼠李素的细胞抗氧化协同作用

潘俊坤，焦中高，张 强

（中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州 450009）

表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）广泛存在于茶叶中，是一种儿茶素类物质，占茶多酚含量的30%～50%[1]。EGCG 结构富含多个羟基基团，具有良好的抗氧化、抗癌、抗炎、降血糖等功能活性[2-4]。异鼠李素（isorhamnetin）广泛存在于银杏、沙棘等植物中，是一种黄酮醇类化合物[5-6]。异鼠李素结构也富含多个羟基基团，具有抗炎、抗氧化、抗癌、降血脂等生物活性[7-10]。

在探寻天然高效抗氧化活性资源的过程中，单一活性成分的抗氧化活性研究备受关注，而复配组分研究尚有不足。有研究发现，单一天然活性成分的抗氧化效果有弱于复配组分的现象发生[11-13]。王娜等[14]利用中效定理分析发现，白藜芦醇与维生素E 在体积比为1:1～7:1 之间具有良好的协同效果（联合作用指数（Combination Idex，CI）<0.95），且当体积比为3:1 时，CI 值最小，其清除DPPH·的半抑制浓度IC50值为0.011 mg/mL，因此当体积比为3:1 时该复配组分具有最佳的协同抗氧化作用。

近年来，已有报道化合物组合对细胞模型相关活性影响的研究。Liu 等[15]研究槲皮素（5 μmol/L）和EGCG（5 μmol/L）联合处理对HepG2 细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的影响，首次报道miR-27a-3p 和miR-96-5p 通过抑制FOXO1 表达参与槲皮素和EGCG联合作用棕榈酸诱导的胰岛素抵抗的协同保护作用。Pan 等[16]研究酚酸和胡萝卜素对H2O2诱导的H9c2 细胞的协同抗氧化作用发现，酚酸增加了细胞对胡萝卜素的摄取及其膜转运蛋白的表达。酚酸含量较高的组合具有协同作用，其中β-胡萝卜素:咖啡酸=1:2 时，显著抑制了细胞内ROS，Synergistic rate（SR）>1 表现出协同作用，并增加了细胞核Nrf2 的表达。关惠[17]的研究发现槲皮素和儿茶素（12.5+12.5 μmol/L）通过靶向FOXO3协同抑制CHUK基因转录增强细胞抗氧化应激的分子机制可能是：槲皮素和儿茶素通过共同作用于CHUK转录因子FOXO3的DNA 结合域，干扰靶基因DNA 的结合，并破坏蛋白-DNA 复合物的稳定性，进而协同抑制FOXO3与CHUK启动子序列的结合，抑制CHUK的转录表达，影响CHUK下游基因表达，从而协同增强细胞抗氧化应激作用。因此研究具有协同增效的细胞抗氧化活性植物天然成分，为食源性类黄酮功能性食品的开发提供理论依据。

本研究通过2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐[2,2-Azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride solution，AAPH]诱导构建了HepG2 细胞抗氧化模型，设置EGCG 和异鼠李素组合质量浓度比为7:4、6:4 和6:5，通过此模型验证了不同比例EGCG 和异鼠李素组合对HepG2 细胞抗氧化作用，采用Chou-Talalay中效分析法评价不同比例的EGCG 和异鼠李素细胞抗氧化协同效应，并进一步探究联合指数（Combinaion Index，CI）最优组合对HepG2 细胞内抗氧化相关酶的影响。研究结果为揭示EGCG 和异鼠李素抗氧化应激的协同增效机制提供了理论依据，同时为明确膳食中抗氧化成分的生物学功能提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

EGCG 标准品（98%）、异鼠李素标准品（98%）、最小必需培养基（Minimum Essential Medium，MEM）、PBS 缓冲液（phosphate buffer solution）、胰蛋白酶、CCK-8 试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；2,2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐[2,2-Azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride solution，AAPH]、2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（2',7'-Dichlorfluorescin diacetate，DCFH-DA）、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）Gibco 公司；Western、IP 裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒 碧云天科技公司；总超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒、总谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒 南京建成生物工程研究所；HepG2细胞 中科院昆明动物所。

CO2培养箱 Thermo Fisher 公司；SpectraMax i3X 酶标仪 Molecular Devices 公司；XDS-1 系列倒置生物显微镜 重庆重光实业有限公司；SW-CJ-2FD 超净工作台 苏州净化设备有限公司；Centrifuge 5427R 离心机 德国Eppendorf 公司；-80 ℃冰箱 青岛海尔特种电冰柜有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；GL224i-1SCN 分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 联合指数法 采用CompuSyn 分析软件计算EGCG 和异鼠李素组合细胞抗氧化活性的联合指数CI[18]。联合指数公式为：CI=（D）1/（DX）1+（D）2/（DX）2，其中（D）1、（D）2分别为复配处理时，活性达到x%，两种植物化学各自浓度，DX 为单一物质活性达到x%所需的物质浓度[19]。当CI<1 时，表示协同作用；CI=1 时，表示相加作用；CI>1 时，表示拮抗作用。

1.2.2 细胞培养 HepG2 细胞为贴壁细胞生长，该细胞培养在10%胎牛血清、1%双抗（100×）的MEM培养基中，在37 ℃、5% CO2、95%湿度培养箱中孵育，每1～2 d 更换培养基。当细胞在培养瓶中生长到80%～90%后，移除培养基，常温下PBS 清洗1～2 次，加入1～2 mL 含EDTA 的胰蛋白酶消化液于25 cm2培养瓶中，消化2～3 min，待细胞消化完成后加入2 mL完全培养基，1000 r/min 下离心5 min，弃去上清液后用完全培养基重悬细胞，按照后续实验需要的细胞数量进行传代。

1.2.3 细胞毒性实验 采用CCK-8 法检测细胞毒性活性，参照Liang 等[18]方法，将密度为5.0×104个/孔的HepG2 细胞接种于96 孔板各孔中，每孔接种100 μL，每组设置6 个重复，培养24 h。实验组每孔加入100 μL MEM 培养基（包含不同浓度比的EGCG+异鼠李素组合，EGCG 或异鼠李素），并设置6 个重复，正常对照组加入相同体积的完全培养基，继续培养24 h 后，每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液培养1～2 h 后，96 孔板放于酶标仪450 nm 处测定OD 值，计算细胞存活率。

1.2.4 细胞抗氧化实验（CAA）参照Tu 等[20]方法取对数生长期的HepG2 细胞，在96 孔板中加入100 μL培养基其细胞密度达到5×104个/孔；培养24 h 后除去培养基，并用PBS 清洗1～2 次；分别加入包含EGCG、异鼠李素，不同质量浓度比的EGCG+异鼠李素组合的DCFH-DA 探针培养基，其中DCFH-DA探针终浓度为25 μmol/mL，继续孵育1 h；1 h 后，去除培养基，每孔加入100 μL 的PBS 清洗3 次；然后加入100 μL 的浓度为600 μmol/mL 的AAPH（Hanks溶液稀释），将96 孔板放入多功能酶标仪检测，恒温37 ℃。酶标仪测定条件为：激发波长485 nm，发射波长538 nm，振荡5 s，然后每5 min 测定一次，测定60 min。计算公式如下：CAA（unit）=1-（∫SA/∫CA），∫SA：样品时间-荧光值曲线下的积分面积；∫CA：对照时间-荧光值曲线下的积分面积；EC50根据lg（fa/fu）/lg（dose）的中效原理计算；fa：CAA unit；fu：1-CAA unit。实验中每个样品做四个重复，实验空白组即加入探针DCFH-DA 但不加AAPH 及抗氧化剂的荧光衰减组；实验阳性对照为加自由基激发剂AAPH 和探针DCFH-DA 的荧光衰减组，样品实验剂量对细胞生长的抑制率在10%以下进行。

1.2.5 细胞内抗氧化酶活性实验 参照Zhang 等[21]和Shi 等[22]取对数生长期的HepG2 细胞浓度为106个/mL，均匀铺于6 孔板内，培养24 h 后待其贴壁生长后清除培养基；加入含EGCG+异鼠李素组合的基础培养基，1 h 后，用PBS 清洗1～2 次；加入1.5 mL 600 μmol/mL AAPH 在37 ℃，5% CO2培养箱里孵育1.5～2 h；阳性对照组加入AAPH 不加抗氧化剂（NC），阴性对照组不加AAPH 和抗氧化剂（PC）；然后用PBS 清洗一次，用细胞刮刀刮下细胞，1000 r/min离心10 min 后收集细胞，弃上清；再加1 mL PBS 离心10 min，弃上清；加入IP 裂解液（加PMSF，100:1，v/v）30～40 min（冰上操作），4 ℃下18495 r/min离心10 min，取上清分装，-80 ℃下保存。按试剂盒说明书进行操作，取适量先进行蛋白含量测定，然后检测总SOD、CAT 和GSH-Px 的活性。

1.3 数据处理

所有结果均以平均值±标准差（mean±SD）表示。通过SPSS 软件对实验数据进行统计分析，采用ANOVA 单因素进行统计学分析，并采用Duncan模块结合事后多重比较进行显著性分析，以P<0.05表示具有统计学显著差异，采用Sigmaplot 10.0 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 EGCG、异鼠李素以及EGCG 和异鼠李素组合的细胞抗氧化活性

CAA 法是一种从细胞水平反映抗氧化剂的吸收和代谢的变化情况，更真实地模拟机体的正常生理状态[23]。CAA 法中荧光探针DCFH-DA 本身没有荧光，但可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后会被细胞内相应的蛋白酯酶水解生成DCFH，此时细胞内的活性氧通过氧化无荧光的DCFH 从而能变成有荧光的DCF，因此检测荧光值就能反映细胞内活性氧的水平[24-25]。

采用HepG2 细胞抗氧化评价模型评价不同浓度梯度下样品的细胞抗氧化活性。如图1 所示，EGCG 和异鼠李素的EC50值分别为6.2±0.2 和3.8±0.1 μg/mL，两者细胞抗氧化活性具有显著性差异（P<0.05）。在联合作用实验中，为了每个单体化合物具有相似的活性，确定每个单体化合物的（EC50）1/（EC50）2为组合物的质量浓度比。并以（EC50）1/（EC50）2比例为参照，调整各个单体化合物质量浓度比例，确定组合物的质量浓度比分别为6:4、6:5、7:4。因此，以EGCG 组（7 μg/mL）、异鼠李素组（5 μg/mL）、组合1（6+4 μg/mL）、组合2（6+5 μg/mL）和组合3（7+4 μg/mL）为各样品细胞抗氧化实验作用浓度。结果显示，EGCG 和异鼠李素组合的EC50值分别为5.0±0.2、5.25±0.2 和5.50±0.2 μg/mL，组合1 的活性优于其他组合活性。EGCG+异鼠李素组合的EC50值分别是EGCG 组的0.81 倍、0.85 倍和0.89 倍，表明EGCG+异鼠李素组合抗氧化活性显著高于EGCG 组（P<0.05）。然而，EGCG+异鼠李素组合的EC50值均高于异鼠李素组，表明组合物的抗氧化活性显著弱于异鼠李素组（P<0.05）。

图1 EGCG 组、异鼠李素组、EGCG+异鼠李素组合的EC50 值Fig.1 EC50 of EGCG,isorhamnetin,and EGCG+isorhamnetin combinations

综上所述，EGCG 和异鼠李素组合可保护HepG2细胞免受AAPH 诱导的氧化损伤。其中，组合1 的细胞抗氧化活性较强。目前，依据不同活性成分相互作用效果的不同将其相互作用关系分为：协同增效作用、拮抗作用和简单加和作用。从生物学角度来看，细胞摄取量对活性成分的生物可及性和生物利用度造成一定影响，并影响其最终在体内抗氧化作用的发挥。Chen 等[26]研究表明，黄酮类化合物（槲皮素、木犀草素）和类胡萝卜素（番茄红素、叶黄素）在总浓度为8 μmol/mL 的不同比例下结合，番茄红素:槲皮素=1:5 复配组作用后，促进了番茄红素的细胞从而增强了其细胞抗氧化活性。Phan 等[27]研究发现，花青素和β-类胡萝卜素联合作用Caco2 细胞时，增加了β-类胡萝卜素的细胞吸收，但对其细胞抗氧化活性产生了拮抗作用，可能与β-类胡萝卜素和花青素共同作用时，β-类胡萝卜素细胞浓度达到一定水平时表现出促氧化作用有关。因此，活性成分的摄取量可能是影响其细胞抗氧化活性的关键因素，也是未来研究方向中需要特别关注的内容。

2.2 EGCG 和异鼠李素组合对HepG2 细胞存活率的影响

利用CCK-8 法，对EGCG、异鼠李素以及EGCG和异鼠李素组合在不同浓度梯度处理HepG2 细胞24 h，进行细胞毒性分析。由2.1 中可知EGCG 和异鼠李素的EC50分别为6.2±0.2 和3.8±0.1 μg/mL，在联合作用实验中，以单体化合物的（EC50）1/（EC50）2为组合的质量浓度比参照，并上下调整质量浓度比例，确定组合物的质量浓度比分别为6:4、6:4、7:4。因此，以EGCG 组（7 μg/mL）、异鼠李素组（5 μg/mL）、组合1（6+4 μg/mL）、组合2（6+5 μg/mL）和组合3（7+4 μg/mL）为各样品CCK-8 实验作用浓度。结果如图2 所示，经不同质量浓度的EGCG、异鼠李素以及不同质量浓度比的EGCG 和异鼠李素组合处理24 h 后，细胞存活率均在90%以上，该浓度下各样品符合后续细胞抗氧化实验细胞毒性要求。EGCG和异鼠李素在不同浓度下，其细胞存活率存在显著性差异（P<0.05）；而EGCG 和异鼠李素组合（6:4，6:5，7:4，c/c）三者之间的细胞存活率无明显差异（P>0.05）。结果表明，本实验中各处理组所使用样品浓度，对HepG2 细胞无明显毒副作用。

图2 EGCG 组、异鼠李素组、EGCG+异鼠李素组合对HepG2 细胞存活率的影响Fig.2 Effects of EGCG group,isorhamnetin group,and EGCG+isorhamnetin groups on the surviral rates of HepG2 cells

2.3 EGCG 和异鼠李素组合联合指数CI

Chou 和Talalay 引入了联合指数（CI）方法，将药物联合效应定量描述为协同效应（CI<1）、加和效应（CI=1）或拮抗效应（CI>1）。随着Chou-Talalay 理论的发展，CompuSyn 软件被开发出来，用于剂量效应分析、CI 计算和Fa-CI 图模拟[28]。本研究采用Chou-Talalay 联合指数法，考察EGCG 与异鼠李素联合作用是否具有协同作用。在联合作用试验中，以EGCG 和异鼠李素的EC50值为指导选择单个浓度。CI 值由CompuSyn 软件计算。EGCG 和异鼠李素在50%、75%和90%抗氧化效果下（GI50、GI75和GI90）的CI 值见表1。

表1 EGCG 和异鼠李素组合的CI 值Table 1 CI value of EGCG+isorhamnetin

如图3 所示，随着浓度的增加各单体及EGCG和异鼠李素组合细胞抗氧化活性也随之增加，呈剂量-效应关系。图3A～图3C 中，浓度在0～5 μg/mL时，异鼠李素组的CAA 值最高，为53.5%±2.7%，与EGCG 组和组合的CAA 值具有显著性差异（P<0.05）；浓度在10 μg/mL 时，组合的CAA 值此时最高，分别为65.6%±2.3%、70.1±2.5%和68.2±2.2%，且与浓度为5 μg/mL 时的EGCG 组（51.6%±1.7%）和异鼠李素组（53.5%±2.7%）的活性存在显著性差异（P<0.05）。结果表明，EGCG+异鼠李素组合可能具有协同作用。

图3 EGCG（7 μg/mL）、异鼠李素（5 μg/mL）、EGCG+异鼠李素组合的CAA 值Fig.3 CAA of EGCG (7 μg/mL),isorhamnetin (5 μg/mL)and EGCG+isorhamnetin

依据图3 中各单体及组合在相应浓度下的CAA值，经过CompuSyn 软件计算，得到EGCG 和异鼠李素组合的CI 值，结果如表1 所示。表1 是利用联合指数法计算出各不同浓度EGCG 和异鼠李素组合联用时的平均CI 值，从表1 可以看出EGCG 和异鼠李素联合作用时，在浓度比为6:4 和6:5 时，具有协同作用。EGCG 和异鼠李素的联合使用，在两者的浓度为7:4 时，其联合用药系数CI 约为1，联合用药指数均值（CIavg）为1.00，表现出了叠加作用。在两者的浓度比为6:4 时，其中，GI75和GI90均小于0.80，说明两者在浓度为6:4 时表现出了较强的协同作用，联合用药指数均值（CIavg）为0.76。在两者的浓度比为6:5 时，GI50约为1，GI75和GI90小于1，说明两者在浓度为6:5 时表现出了较弱的协同作用，联合用药指数均值（CIavg）为0.95。图4 为EGCG和异鼠李素组合（6:4）在CIavg最小时的Fa-CI 趋势图，随着Fa 值的增加，CI 值呈降低趋势，即表明随着细胞抗氧化活性的增加，EGCG 和异鼠李素组合的协同增效作用更佳。结果表明，在一定的浓度范围内，EGCG 和异鼠李素组合对HepG2 细胞具有协同抗氧化保护作用。EGCG+异鼠李素（6:4）的CI 值为最佳组合，因此选用EGCG+异鼠李素（6:4）进行后续实验。

于佳成[29]发现，槲皮素与儿茶素（12.5 μmol/L+12.5 μmol/L）的浓度组合对H2O2诱导HepG2 细胞氧化损伤具有协同保护作用，其联合指数CI 值为0.374，表明组合协同效果较好；进一步细胞内抗氧化酶实验发现，二者联合处理后，SOD、CAT、GPx 活性和MDA 含量比单药处理显著性降低，说明槲皮素和儿茶素组合在消除ABAP 诱导的HepG2 细胞氧化应激酶活方面具有一定的协同增效作用。Saw等[30]也研究发现，低浓度下的槲皮素和山奈酚，槲皮素和紫檀芪以及山奈酚和紫檀芪组合通过上调Nrf2通路上的mRNA 和蛋白的表达，增加了其清除自由基（ROS）等能力，对H2O2诱导HepG2-C8 细胞氧化损伤达到协同抗氧化保护效果。研究结果与本文结果趋势一致，组合物对细胞都起到了协同保护作用。然而，这些结果表明，每个组合的协同作用水平与单个化合物的抗氧化作用无关，剂量效应关系并不能说明其机制，它只显示了质量作用律参数[31]。基于以上结果，EGCG 与异鼠李素联用潜在的协同作用机制有待进一步探讨。

2.4 细胞内抗氧化相关酶活性

ROS 的过量产生导致细胞内氧化应激失衡，从而可能导致细胞损伤，是导致慢性疾病的主要因素，包括衰老、心血管病、高血压和神经退行性疾病[32]。AAPH 诱导ROS 生成可引起细胞内抗氧化防御系统失衡，SOD、CAT 和GSH-Px 是清除自由基的主要酶。抗氧化酶系统对氧化应激损伤起着重要的防御作用。为了评估抗氧化酶系统是否在HepG2 细胞中发挥作用，检测了抗氧化酶（SOD、CAT 和GSH-Px）的活性，这些酶在人体氧化应激平衡中起着重要作用[33]。因此，细胞内抗氧化酶活性的变化可以反映HepG2 细胞抑制活性氧（ROS）的能力。

为了进一步阐明EGCG 与异鼠李素（6:4）联合抗氧化的作用机制，对SOD、GSH-Px 和CAT 的活性进行了测定。结果如表2 所示，与PC 细胞相比，NC 细胞在600 μmol/mL AAPH 作用1 h 后，SOD、CAT 和GSH-Px 活性分别显著降低51.2%、53.5%和57.1%，表明AAPH 对HepG2 细胞产生了氧化损伤。而当EGCG 和异鼠李素组合提前孵育1 h 后，结果发现HepG2 细胞内SOD、CAT 和GSH-Px 相比于NC 均有上升且随剂量增加而增强加。如表2结果，与NC 细胞相比，EGCG 和异鼠李素组合在浓度1.5+1 μg/mL 作用细胞时，SOD 无显著性差异（P>0.05），然而在3+2 μg/mL 和6+4 μg/mL 时，具有显著性差异（P<0.05），且CAT 和GSH-Px 的活性与SOD 相似。相比于NC 细胞，EGCG 和异鼠李素组合作用与HepG2 细胞，其SOD 活性分别增加了5.2%、21.1%和49.1%；GSH-Px 的活性分别增加了7.6%、27.8%和57.6%；CAT 活性分别增加了5.6%、24.6%和42.1%。结果与CAA 测定结果一致。组合具有较好的细胞抗氧化活性，抗氧化酶活性也较高。

表2 EGCG 和异鼠李素组合（6:4）对HepG2 细胞抗氧化相关酶的活性的影响Table 2 Effects of EGCG+isorhamnetin (6:4) on activities of antioxidant enzymes in HepG2 cells

综上所述，EGCG 与异鼠李素（6:4）组合可通过调节抗氧化酶活性抑制AAPH 诱导的HepG2 细胞氧化应激。同时，高浓度组合在样品组中SOD、CAT 和GSH-Px 的活性最好。结果表明，适当浓度的组合表现出更好的抗氧化酶活性，说明较高的酶活性是细胞抗氧化协同作用的机制。Wen 等[34]发现荔枝叶肉桂素B1 通过上调SOD、CAT 和GSH-Px 活性，可抑制较强的细胞内抗氧化活性。Jiang 等[35]报道Jiupei 肽具有良好的细胞抗氧化活性，SOD、CAT和GSH-Px 活性呈剂量依赖性增加。Zhou 等[36]研究发现，马氏螯虾肉中的抗氧化肽可显著提高HepG2细胞谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢酶（CAT）的产生，以及Nrf2 信号通路相关基因的表达。同样，Huo 等[37]也报道了白酒中的抗氧化肽通过清除活性氧（ROS）和上调细胞抗氧化酶（SOD、CAT 和GSH-Px）活性发挥保护作用。如图5 所示，EGCG 和异鼠李素组合可以穿过细胞膜，增加SOD、CAT 和GSH-Px 的活性，共同清除活性氧（reactive oxidative species，ROS）。结果表明，EGCG 和异鼠李素联合作用主要提高了HepG2 细胞的抗氧化酶活性。因此，EGCG与异鼠李素联用的协同机制为：上调较高的SOD、CAT 和GSH-Px 活性，来抑制ROS 的产生，从而达到平衡机体氧化应激反应的效果，为食源性类黄酮功能性食品的开发提供理论依据。

图5 EGCG 和异鼠李素组合在HepG2 细胞内协同抗氧化作用机制示意图Fig.5 Possible mechanisms of EGCG+isorhamnetin combination antioxidant activities in HepG2 cells

3 结论

综上所述，EGCG 和异鼠李素组合联合应用对HepG2 细胞的协同增效保护作用，与单独使用EGCG或异鼠李素相比，联合作用通过上调细胞内抗氧化相关酶活性更大程度地清除HepG2 细胞内的ROS。但本研究仍有许多不足之处：本研究仅限于体外单一细胞系，在后续的研究中可在多种细胞系中进行验证，在条件允许下可进一步在动物实验或临床实践中进一步验证；EGCG 和异鼠李素联合应用在体内的毒性研究需要进一步验证；后续研究中可在分子水平上进一步阐释EGCG 和异鼠李素的细胞抗氧化协同作用的分子机制。本研究虽存在这些局限，但初步结果表明，EGCG 和异鼠李素联合应用可能是一种潜在的抗氧化剂的候选组合，并为其后续功能性产品的开发奠定了理论基础。