补中益气汤单用或联用益生菌合剂上调SP7、RUNX2提高脾虚证骨质疏松大鼠骨密度

马可蓝， 董恩钊， 林营， 冯学烽

[1.广州中医药大学，广东广州 510006；2.广州中医药大学顺德医院（佛山市顺德区中医院），广东佛山 528333]

骨质疏松症是以骨强度下降和骨折风险性增高为主要表现的骨骼系统疾病[1]。骨质疏松症流行病学调查[2-3]结果表明，骨质疏松症已经成为我国50 岁以上人群的重要健康问题，中老年女性骨质疏松问题尤为严重。运用中西医整体医疗模式治疗、预防及监测骨质疏松症已成为最有效的方法[4]。骨质疏松症归属于中医学“骨痿”“骨枯”“骨极”“骨痹”等范畴，因其临床表现多为肢体软弱无力、麻木疼痛等症状，遂目前较为公认的病名当推“骨痿”[5]。李东垣在《脾胃论》中指出“脾病则下流乘脾肾……则骨乏无力，是为骨痿。会人骨髓空虚，足不能履地。”根据《黄帝内经》提出“治痿独取阳明”的治疗大法，及现代从脾治痿论治骨质疏松[6]的深入，补中益气汤当为补脾益气治疗脾虚证骨痿之代表性方剂，治疗上以甘温之品黄芪、党参、干姜为主健脾益气，升举中阳。既往临床研究[7]表明，补中益气汤可以调节脾胃气虚型老年骨质疏松性椎体压缩骨折（OVCF）术后患者骨代谢指标，促进成骨，提高骨密度，同时可以增加四肢骨骼肌肌量和股四头肌肌力，减轻临床症状，改善生存质量。动物实验研究[8]表明，补中益气汤可对抗环磷酰胺导致的小鼠骨质量下降，预防骨质疏松。另外，近年研究表明，益生菌不仅可以调节脾虚证的各种疾病[9]，也可用于治疗骨质疏松[10]。因此，本研究着眼于通过健脾治疗改善骨质疏松，观察补中益气汤与益生菌合剂单用或联用对脾虚证骨质疏松大鼠的影响，以期在临床使用中，根据患者的各种情况综合评估如何选择使用补中益气汤和益生菌合剂进行治疗，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物40 只SPF 级6月龄雌性SD 大鼠，体质量（200±20）g，购自广州中医药大学实验动物中心，实验动物生产许可证编号：SCXK（粤）2018-0034。大鼠在广州中医药大学实验动物中心动物房[实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2018-0001]内喂养。实验方案获得广州中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号：20210331002。

1.2 药物及制备补中益气汤由黄芪、升麻、柴胡、党参、炙甘草、当归、陈皮、白术组成，上述中药材及番泻叶购自广州中医药大学顺德医院药剂科。将黄芪、升麻、柴胡、党参、炙甘草、当归、陈皮、白术原药材以15∶3∶3∶10∶7.5∶3∶3∶5的比例，放入10 倍量蒸馏水中浸泡2 h，常规煎煮3 次，滤过，将3 次滤液合并后水浴浓缩成1 g生药/mL，降温后放置于4 ℃冰箱中保存备用。将番泻叶置于10倍量蒸馏水中浸泡2 h，煎3次，滤过，将3次滤液合并后水浴浓缩成每mL含1 g生药，降温后放置4 ℃保存备用。极菌开益生菌固体饮料合剂（主要成分：长双歧杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种，日本凯菲亚株式会社生产，批号：91650）。地塞米松磷酸钠注射液（西南药业股份有限公司生产，批号：211104）。

1. 3 主要试剂与仪器重组Anti-SP7 抗体[EPR21034]、重组Anti-RUNX2 抗体[EPR22858-106]-ChIP Grade、Anti-beta-actin 抗体[AC-15]（美国Abcam 公司）；山羊抗兔IgG（H+L）、小鼠/人ads-HRP 二抗（美国Southern Biotech 公司）。小动物专用双能X 射线骨密度仪（美国豪洛捷医疗公司）；SkyScan 1276 Micro-CT（德国布鲁克公司）；微型垂直电泳仪和电泳装置（美国伯乐公司）；核酸蛋白分子仪（德国贝克曼公司）。

1.4 造模大鼠适应性喂养1 周后，构建脾虚证骨质疏松症模型，方法：灌胃番泻叶煎液（10 g·kg-1，每日1 次）[11]，同时皮下注射地塞米松磷酸钠注射液（0.6 mg·kg-1，每3 d 1 次）[12]，造模时间为4 周。造模结束后，若大鼠出现明显成群蜷缩，嗜睡，反应迟钝，活动减少，四肢无力，行动缓慢，皮毛枯槁，排便次数增多，便溏，紧张焦虑，容易激怒等表现，则判断脾虚证造模成功[13-14]。若骨密度（BMD）峰值减少≥2.5 标准差（SD），则判断骨质疏松症模型构建成功[12]。

1. 5 分组与给药将建模成功的大鼠随机分为4 组，即补中益气汤组、联合组、益生菌合剂组以及模型组，每组10只。给药剂量根据等效剂量为成人一日量的6.3倍计算。补中益气汤组：给予补中益气汤水煎液4.46 g·kg-1·d-1灌胃；联合组：给予补中益气汤水煎液4.46 g·kg-1·d-1和极菌开益生菌合剂蒸馏水混悬液6.98 g·kg-1·d-1灌胃；益生菌合剂组：给予极菌开益生菌固体饮料合剂蒸馏水混悬液6.98 g·kg-1·d-1灌胃；模型组：给予等体积生理盐水灌胃。每日1次，连续治疗4周。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 一般情况观察 造模与干预期间，每周测定大鼠体质量，同时观察大鼠的进食量、精神状态、行为变化以及皮毛色泽等。

1.6.2 双能X 射线吸收法（DEXA）检测骨密度干预结束后，麻醉处死大鼠，将股骨剥出，用10%福尔马林溶液浸泡，用小动物专用双能X射线骨密度仪进行扫描，并分析股骨密度。

1.6.3 Micro-CT 扫描分析股骨组织 使用Micro-CT 扫描仪对取出的大鼠股骨进行扫描。扫描后，重建选择区域，得到重建图像，重建后使用CT Analyser 软件对感兴趣区域（ROI）进行分析。计算骨小梁微观结构参数：骨小梁数（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、体积分数（BV/TV）等。

1.6.4 Western Blot 法检测股骨组织SP7、RUNX2蛋白表达水平 处死大鼠后迅速剥离股骨，并迅速保存在干冰中。取样完毕后，在骨组织中加入少许液氮，研磨匀浆，加入裂解液过夜，收集蛋白溶液。测定蛋白浓度后根据浓度调整样品蛋白用量，加入上样缓冲液，沸水浴5 min。吸取样品上样，进行电泳及转膜。将转好的膜于室温脱色摇床上用5%脱脂牛奶封闭1 h。分别加入重组Anti-SP7 抗体（稀释倍数1∶1 000）、重组Anti-RUNX2 抗体（稀释倍数1∶1 000）、Anti-beta-actin抗体4 ℃孵育过夜。更换二抗室温孵育后，使用ECL 显色液曝光显影，应用ImageJ 软件处理系统分析目标条带的光密度（OD）值。

1. 7 统计方法采用GraphPad Prism 8.0、SPSS 27.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较造模期间：第1周，各组大鼠一般状态比较基本无差异；第2周，各组大鼠开始出现毛发无泽、掉毛现象，爪甲颜色较浅，大便较稀软，且体质量开始增长减缓；第3 周，大鼠出现大便清稀，甚者如水状，爪甲颜色变淡，毛发枯萎无华，尾巴凉，弓背倦怠，喜扎堆，体质量增长进一步减少；第4周，各组大鼠明显成群蜷缩，嗜睡，反应迟钝，活动减少，四肢无力，行动缓慢，同时皮毛爪甲失去正常润泽而枯槁，进食量少，排水样便，次数增多，紧张焦虑，容易激怒。各组大鼠造模期间体质量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见图1。提示脾虚证造模成功。

图1 各组大鼠造模期间体质量比较（±s）Figure 1 Comparison of body mass during modeling among each group of rats（±s）

造模成功后开始分组药物干预。分组干预治疗1周后，各组大鼠一般情况基本无明显差异；治疗2周后，与模型组比较，补中益气汤组、联合组及益生菌合剂组大鼠毛发色泽开始可见些许光泽，爪甲稍变红，大便性状虽仍质稀、次数多，但较前已有所好转，体质量稍增长，组间比较，联合组大鼠体质量显著高于模型组（P＜0.05）。治疗3 周后，与模型组比较，3 个干预组大鼠无扎堆现象，尾巴温度恢复正常，毛发色泽出现光泽、掉毛情况少，爪甲变红，大便稀软但成形，大便量及次数较前减少，体质量持续增长，组间比较，3 个干预组大鼠体质量均高于模型组（P＜0.05 或P＜0.000 1），且联合组体质量高于其他2个干预组（P＜0.05）。治疗4 周后，与模型组比较，3 个干预组大鼠摄食量佳、精神状态良好、机敏好动，毛色鲜亮，大便质地恢复、无便溏症状，体质量明显增加，组间比较，3个干预组大鼠体质量均高于模型组（P＜0.01 或P＜0.000 1），且联合组体质量高于补中益气汤组、益生菌合剂组（P＜0.01 或P＜0.001），结果见表1。

表1 各组大鼠药物干预期间体质量比较Table 1 Comparison of body mass during pharmacological intervention among each group of rats（±s）

表1 各组大鼠药物干预期间体质量比较Table 1 Comparison of body mass during pharmacological intervention among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.000 1，与模型组比较；④P＜0.05，⑤P＜0.001，与益生菌合剂组比较；⑥P＜0.05，⑦P＜0.01，与补中益气汤组比较

组别补中益气汤组联合组益生菌合剂组模型组鼠数/只10 10 10 10干预期间体质量/g开始治疗时215.73±2.08 215.46±2.19 215.58±7.45 215.36±6.48第1周220.41±2.30 222.52±2.24 220.10±7.41 218.42±6.92第2周227.73±2.34 231.52±2.36①227.24±7.38 222.93±6.97第3周236.85±2.53①242.55±2.44③④⑥236.41±7.42①230.06±6.96第4周248.16±2.64②256.36±2.51③⑤⑦247.61±7.33②238.99±6.77

2. 2 各组大鼠股骨骨密度比较图2 结果显示：与模型组比较，补中益气汤组、联合组及益生菌合剂组大鼠股骨骨密度明显增高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）。

图2 各组大鼠股骨骨密度（BMD）比较（±s）Figure 2 Comparison of bone mineral density（BMD）among each group of rats（±s）

2.3 各组大鼠骨小梁微观结构参数比较图3 结果显示，与模型组比较，补中益气汤组、益生菌合剂组及联合组的Tb.N、Tb.Th及BV/TV显著升高（P＜0.05 或P＜0.01），Tb.Sp 明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中联合组改善效果最明显。

图3 各组大鼠骨小梁微观结构参数比较（±s）Figure 3 Comparison of microstructural parameters of bone trabeculae among each group of rats（±s）

2. 4 各组大鼠骨组织中SP7 和RUNX2 蛋白表达比较图4结果显示，与模型组比较，补中益气汤组、联合组及益生菌合剂组大鼠骨组织SP7 和RUNX2 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05 或P＜0.001或P＜0.000 1）。其中，联合组SP7和RUNX2蛋白表达水平显著高于补中益气汤组、益生菌合剂组（P＜0.05或P＜0.001）。

图4 各组大鼠骨组织中SP7和RUNX2蛋白表达比较（±s）Figure 4 Comparison of protein expressions of SP7 and RUNX2 in bone tissue among each group of rats（±s）

3 讨论

骨质疏松症是中老年人群中常见的骨退行性变疾病[15]。《灵枢·五癃津液别》中指出：“五谷之津液和而为膏者，内渗于骨空，补益脑髓。……下过度则虚，虚极腰背痛而胫酸。”骨痿的发病与脾虚密切相关，脾虚则气血两虚，骨髓失养，精亏髓空，肢体倦怠无力而致骨痿。《素问·五脏生成》曰：“肾之合骨也，其荣发也，其主脾也。”脾气虚，运化失常，气血津液生化无源，则骨髓失后天之养而痿。蒋宁等[16]研究发现，补中益气颗粒可显著提高骨质疏松小鼠的骨量，明显抑制成破骨活性。补中益气汤中君药黄芪的主要活性成分黄芪多糖不仅可以提高大鼠骨密度[17]，还可以上调大鼠肠道中有益益生菌的含量[18]。加之补中益气汤本身即有促进肠道菌群生长的作用[19]。故补中益气汤值得深入研究。

此外，有证据表明，调节肠道菌群可以改善骨骼健康，是治疗骨质疏松症的一种有前途的方法。Ohlsson 等[20]研究发现，益生菌可保护卵巢切除小鼠的皮质骨，减少骨量流失。益生菌还可以通过减轻炎症和促进骨形成来提高骨密度。Whisner 等[21]研究发现，益生菌可以通过减轻肠道炎症和增加骨形成来预防骨量流失，这种保护作用依赖于肠道微生物。加之益生菌复合制剂能够调节脾虚证大鼠胃肠激素水平，改善其免疫功能[22]。故推测补中益气汤联合益生菌合剂有望更好地治疗脾虚证骨质疏松。

本研究构建脾虚证骨质疏松症大鼠模型，观察补中益气汤、益生菌合剂单用或联合治疗脾虚证骨质疏松症大鼠的疗效，结果表明，补中益气汤、益生菌合剂单用及联合用药不仅可以明显改善大鼠脾虚证症状，促进体质量增长，还可明显促进股骨BMD 增加，Micro-CT 三维重建图像示股骨骨小梁组织较模型组更致密，骨小梁数目（Tb.N）及骨小梁厚度（Tb.Th）均有所增加且排列有序，骨小梁分离度（Tb.Sp）减小，连续性增强，骨量丢失较少，且联合治疗效果优于单用补中益气汤或益生菌合剂。

近年来Runt 相关转录因子2（RUNX2）/SP7 引起了骨生物学上的极大重视，被认为是骨形成调节作用机制的新途径。RUNX2 可影响成骨细胞分化、软骨细胞发育成熟及终末分化软骨细胞转分化为成骨细胞[23]，并且RUNX2 高表达可促进成骨细胞合成骨基质[24]。SP7（Osterix）是迄今被发现的唯一的成骨细胞特异性转录因子，是骨形成不可缺少的蛋白，可调节成骨、软骨相关基因表达，并促进成骨细胞分化、成熟与骨形成等，参与骨骼发育的过程[25]。同时，RUNX2 可通过调节下游的SP7，诱导成骨细胞祖细胞增殖并分化为成骨细胞[26]。本研究结果表明，补中益气汤、益生菌合剂单用或者联合用药均能上调骨质疏松大鼠骨组织RUNX2和SP7表达，且以联合用药的效果最明显。

综上所述，补中益气汤、益生菌合剂单用或联合使用可激活RUNX2/SP7 途径，上调大鼠骨组织RUNX2 和SP7 表达，提高脾虚证骨质疏松症模型大鼠骨密度，使受损骨结构得到改善。本研究仅明确了该机制与RUNX2/SP7 途径相关，具体作用机制尚待进一步探讨。另外，肠道菌群的类型多种多样，究竟哪几类菌群是以何种方式影响骨代谢机制尚未完全掌握，需要加以探究。未来研究需更好地融合辨证思想和可能机制，整合补中益气汤与联合益生菌合剂在骨质疏松治疗中的相通之处。