异常糖基化在肺癌中的应用进展

郭艺彤 杨卫华

目前,全世界成千上万的人被诊断罹患各种类型的癌症,癌症是一组以异常细胞的生长和增殖为特征的疾病,如果不经过及时规范的治疗,病情可在数月内进展并最终导致死亡。在恶性肿瘤的发病率和死亡率中,第一位均为肺癌,我国肺癌的死亡率较欧美国家高出约30%[1],肺癌引起的死亡率将超过乳腺癌、前列腺癌和结肠癌[2]。非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)5年生存率仅为23%,小细胞肺癌(small cell lung carcinoma,SCLC)仅为6%,除了肺癌发现时多数已处于晚期,伴全身多处转移这一特征导致高死亡率外,另外可能与早期诊断特异度及敏感度差有关[3]。血清学相关指标中包括癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌抗原(SCC)、神经特异性烯醇化酶(NSE)、细胞角蛋白片段19(CYFRA21-1)等传统肿瘤标志物检测对肺癌的诊断及预后评估有一定的参考意义,但在其特异度及敏感度方面,具有一定局限性。近年来,随着糖生物学的研究,利用细胞表面的异常糖蛋白作为来源,获取可能存在的癌症信息的检测技术的发展[4],为诊断和疗效评价开辟了新的思路,比如基于异常糖基化,已在临床上进行的异常糖链糖蛋白(TAP)的检测。本文就异常糖基化在肺癌中的研究进展作一综述。

一、传统肿瘤标志物

1 CEA

CEA是一种具有人类抗原特性的分子量为200000kDa的酸性糖蛋白,其可来自于正常胚胎的消化管组织,亦可来自于消化系统肿瘤[5]。1965年由Gold和Freedman首次进行描述。过去几十年的研究证明,CEA在癌症进展、炎症、血管生成和转移中发挥重要作用[6]。一项针对良恶性胸腔积液鉴别的研究中[7],恶性胸腔积液组的CEA与良性组明显具有统计学差异。在Rafael Molina[8]关于肺结节患者的报道中,对肺结节人群进行肿瘤标志物的检验,并对患者进行肺结节的病理检查,一部分患者确诊肺部恶性肿瘤,对此经过统计分析,CEA诊断肺癌的敏感度为56.5%,特异度为93.5%。尽管如此,CEA并非肺癌的特异性标志物,其表达水平在其他多种类型的癌症例如乳腺癌、结直肠癌中均有上升,并且在妊娠期、长期吸烟等人群中也会有部分人出现CEA升高,呈现假阳性[9]。目前CEA仍是肺癌诊断的常规项目,许多报道提出联合检测可提高敏感度和特异度。

2 SCC

SCC是鳞状细胞癌的特异性标志物,在过往的研究报道中,SCC是公认的诊断宫颈鳞癌的指标。可以作为评估宫颈鳞状细胞癌的独立预后因素[10]。当罹患肺鳞状细胞癌时,SCC也可能会出现升高,但其敏感度较低,在肾脏、皮肤、肺部和肝脏的良性疾病中,假阳性很常见[11]。SCC在宫颈癌方面的研究资料较多,一项关于是否仅凭SCC水平能将宫颈癌、肺癌或头颈癌与其余健康或良性疾病区分开的多中心回顾研究中[12],敏感度为61.4%,特异度为95.6%。肺鳞状细胞癌与健康人比较的95%CI为34.4%,肺部良性患者为39.1%。相较于SCC水平在宫颈鳞癌中的表现,在肺癌中,SCC对健康人群、良性疾患人群和肺癌类型的区分能力中等。根据杨启贤[13]等报道,SCC对肺癌筛查的意义不大(AUC<0.7),无论筛查的人群中是否包括良性肺部疾病患者。

3 NSE

NSE是一种78 kDa的γ-同型二聚体糖酵解酶,广泛表达于神经内分泌组织[14],并可过度表达在神经母细胞瘤和SCLC中。据此通常用来诊断SCLC,其数值的升高与肿瘤直径较大、分期晚期和远处转移呈正相关,同时在评估放化疗疗效方面有很好的性能[15]。在SCLC中,NSE为何会表达上调的机制尚不清楚,可能与调节NSE表达的miRNA有关,长链非编码RNA(lncRNA)是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA,通过调节mRNA表达调节各种生物功能,在癌变过程中发挥了重要作用[16]。虽然NSE在SCLC诊断及疗评方面甚为重要,但在NSCLC肝转移的研究中,NSE在转移组和非转移组表现出了统计学差异,提示我们NSE可有助于预测NSCLC的肝转移可能。此外相比于单一检测,NSE联合CA125的检测在肺部恶性肿瘤中则更具特异度和敏感度[14],得出联合检测中可接受的敏感度、特异度和曲线下面积分别为51.2%、72.6%、0.64,均高于单一检测。

4 CYFRA21-1

CYFRA21-1是细胞角蛋白19(CK19)的一个片段,在上皮细胞来源的肿瘤中,caspase 3蛋白酶活性的增加促进CK19的降解,降解后的片段被释放到外周循环中,因此片段的数量可反映上皮来源肿瘤的发生发展[7],例如肺鳞癌、头颈部鳞癌,在良性疾病中一般不见升高。其与NSCLC的相关性研究中,CYFRA21-1在NSCLC Ⅰ～Ⅱ期的水平并没有显著升高,在晚期(Ⅲ～Ⅳ)期则显著高于早期组(P<0.001)[17]。另外CYFRA21-1也在SCLC中升高,却不能仅仅据此与NSCLC相鉴别。在疗评方面,针对晚期NSCLC患者的治疗手段仍以化疗为主,铂类是常用的药物之一。在此相关的疗效评价研究中[18],第一个化疗周期前后CYFRA21-1的变化率与化疗疗效呈负相关。第二个周期后,患者被分为疾病控制(DC)组和进展性疾病(PD)组,广义线性模型和线性趋势检验均表明CYFRA21-1的变化率与NSCLC的化疗疗效呈负相关。该项研究还联合了CEA,两者联合的ROC曲线下面积(0.87,95%CI0.71～1.00),优于单个CYFRA21-1检测(0.71,95%CI0.49～0.94)或单个CEA变化率(0.85,95%CI0.69～1.00)的预测(P<0.001)。在Cox回归分析中[19],CYFRA21-1是肺癌的独立预后因素,表达的升高与转移有相关性,转移部位包括脑(P<0.05)、肝(P<0.05)、淋巴结(P<0.001)、肺(P<0.05)。

综上,无论是哪种肿瘤标志物,单一检测的敏感度和特异度相比于联合检测总不尽如人意,在预后、疗效评价方面亦是如此。例如胃泌素释放肽前体(proGRP)和NSE联合应用诊断的ROC曲线下面积(0.9426)高于NSE单独应用(0.8554,P<0.05)[17]。因此有越来越多的研究者及临床工作者提出两种及两种以上的肿瘤标志物联合检测会有助于提高肺癌诊断的敏感度和特异度。

二、异常糖基化

1 糖基化与异常糖基化

糖基化是生物体分子修饰的一种重要方式,以糖基转移酶作为媒介,将糖转移到蛋白质和蛋白质上的氨基酸残基,从而形成糖苷键。起点位于内质网,终点在高尔基体。它通过改变蛋白质的折叠和空间构象来影响生物功能,如细胞循环、信号转导和基因表达。糖基化是真核生物体内主要的运转方式,存在于超过一半的蛋白质中。

糖基化有多种途径,它们通过糖-蛋白质连接、与蛋白质连接的初始单糖和独特的起始酶来区分,例如N-糖基化、O-糖基化,这两种是哺乳动物中主要的类型。

正常的糖基化能够调节蛋白质的功能效应,而异常的糖基化则会对脂质代谢、糖尿病肾病、心血管疾病、动脉粥样硬化、血管钙化等生理过程和疾病的发生产生一定的影响[20]。除此之外,异常糖基化还可引起细胞恶变、转移,已被认为可对癌基因和抑癌基因、细胞凋亡、血管生成、生长因子受体等过程造成影响。相对于同样与恶性肿瘤关联的生物学标志物如蛋白质及核酸,糖基化研究报道相对较少,主要是因为癌症中糖基化的结构功能及相关变化过程比某些蛋白质与基因在癌细胞表型中的功能作用更难理解。

糖基表位表达水平的不同会导致不同的结果,一些糖基表位高表达促进了肿瘤的侵袭和转移,导致患者的5～10年生存率缩短,一些糖基表位的表达抑制了肿瘤的进展,术后生存率提高。糖基化依赖性促进或抑制肿瘤进展的相关概念是在临床病理研究中发展起来的。前一类促进表位例如N-连接结构中的6GlcNAc分支;O-连接结构中的唾液酸Tn;后一类抑制表位例如唾液酸化Lewis-X和唾液酸化Lea[21]。

已知癌细胞表达异常的糖基化模式,有N-连接聚糖的分支、O-连接聚糖的截短、岩藻糖基化增加、唾液酸化异常等。

2 N-糖基化

N-糖基化的发生地点在内质网和高尔基体,连接点为N-末端氨基酸的α-氨基及赖氨酸或精氨酸的ω-氨基。接收N-聚糖的氨基酸序列通常是Asn-X-Ser/Thr,其中“X”是除Pro之外的任何氨基酸,我们所说的这些过程通常是指在哺乳动物中,因为在一些植物中可能没有糖基化[22]。正常情况时,乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)在N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ(GnT Ⅲ)的催化下形成N-糖链β-1,4分支,研究表明异常情况时,平分的GlcNAc结构能够对某些癌症产生抑制作用[23]。另一种与N-聚糖分支相关的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V(GnT-V,MGAT5)被认为在癌症发生起到了作用。据报道,MGAT5在癌症中通过激活致癌的Ras-Raf-Ets途径而不受调控[24]。在乳腺癌的研究中,受N-糖基化影响的Ⅰ-聚糖分支对癌症进展转移有一定作用[25]。NSCLC中常见表皮生长因子受体(EGFR)突变,针对其突变已有了相应的治疗方法从而改善了肺癌患者的生存。然而控制突变EGFR信号的方法仍然不清楚,一项研究[26]发现NSCLC中,跨膜糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B (GPNMB)的表达与EGFR突变状态呈正相关,且该蛋白在EGFR突变的NSCLC细胞中高度糖基化。GPNMB是一种高度N或O连接的糖基化蛋白,属于Ⅰ型跨膜蛋白。即使没有配体刺激,GPNMB也可激活EGFR突变,促进癌症转移。其中GPNMB的Asn134 (N134)糖基化在其中发挥重要作用。若抑制N134-糖基化过程则可阻止GPNMB调控EGFR突变,并最终抑制NSCLC的转移,不失为在未来可实施的新的治疗方案。

3 O-糖基化

O-糖基化的连接点为丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸的羟基,在高尔基体中,O-聚糖(Tn、sTn和T抗原)借助于几种糖基转移酶(如T-合成酶和唾液酰基转移酶)进行合成。约80%通过分泌途径的蛋白质是属于O-糖基化类型,例如存在于免疫球蛋白中的O-糖基化[20]。O-糖基化异常与癌症患者的不良预后相关,几乎不会出现在正常细胞中。Tn抗原是O-聚糖的常见前体,Tn抗原接收一个半乳糖单位与在内质网中合成的T-合成酶作用下形成T抗原[27]。Tn抗原与唾液酰基转移酶相互作用,并接收一个Neu5Ac单元形成sTn抗原。sTn和Tn抗原在肿瘤细胞中相辅相成,sTn上调与乳腺癌、胃癌和前列腺癌的生长均有关系,通过破坏半乳糖凝集素与末端半乳糖残基的相互作用,促进肿瘤细胞从原发组织中逃逸[28]。在肺腺癌[27]中N-乙酰半乳糖氨基转移酶6 (GALNT6)的上调表达与淋巴结转移和不良预后相关。GALNT6是一种O-糖基化酶,它与糖化伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)相互作用,促进上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),从而促进肺癌的发生发展,并与转移及不良预后相关。若抑制GALNT6可逆转EMT,减少肺癌发生转移的概率。针对GALNT6的靶向治疗可能成为肺癌转移治疗的新途径。

4 岩藻糖基化异常

岩藻糖在岩藻糖基化的催化下形成,参与真核生物体内多种生理和病理过程。岩藻糖基化是岩藻糖残基附着在N-聚糖、O-聚糖和糖脂上,由岩藻糖基转移酶(FUTs)合成。α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)作为一种催化酶,在NSCLC中,Chen等人发现FUT8的上调与肿瘤转移、复发和患者生存率显著相关[25]。FUT8与肺癌患者预后相关,可作为预后生物标志物。敲低FUT8可显著抑制肺癌细胞的远处侵袭和细胞增殖。岩藻糖基化同样也在EMT中发挥作用[29],刺激肺癌的进展,其中的分子机制涉及β-连环蛋白(β-catenin),该蛋白与淋巴样增强子结合因子1 (LEF-1)一起激活FUT8表达,形成FUT8在肺癌中的正反馈。肺癌细胞表面的特定糖蛋白、糖脂等可产生细胞粘附作用,岩藻糖作为细胞粘附识别、信号传递和控制的中介,已经在既往广泛的实验系统中得到了记录。因此通过抑制其粘附被认为可以减少肿瘤转移。α1-酸性糖蛋白(AGP)是一种主要的血清糖蛋白,分子量为41至43 kDa,可作为多种癌症的肿瘤标志物,并评价预后,在肺癌中可发现高水平的岩藻糖基化AGP。在应用免疫治疗的患者中,相关报道称AGP是预测病情进展的独立预测因子[30]。

5 唾液酸化异常

唾液酸是一种九碳糖神经氨酸的天然糖类化合物。主要受唾液酸转移酶(sialyltransferases,STs)的表达控制,STs的大家族约有20余种,控制具有独特生物学作用的特定唾液酸化结构的合成。唾液酸化增加,被证实与癌症密切相关,目前研究较多的癌症包括乳腺癌,在部分乳腺癌患者中检测到IGF2R(胰岛素样生长因子2受体)基因缺失或突变,并据此推断调节IGF2R的糖基化过程异常可与癌症相联系。另一种公认的预测不良预后的生物标志物,L1细胞粘附分子(L1CAM),同样与细胞粘附分子唾液酸化有关[31]。肺癌中α-2,8唾液酰基转移酶过度表达,肺癌细胞表面唾液酸化异常,影响肿瘤的进展及转移。α-2,8唾液酰基转移酶家族众多,例如ST8Sia-Ⅰ、ST8Sia-Ⅱ,ST8Sia-Ⅳ,其表达水平与SCLC患者预后相关,随着细胞中的ST8Sia-Ⅰ表达增强,肺癌细胞的侵袭及转移能力也显著增加,与恶性程度成正比。而在卵巢癌中[32],α-2,3-连接的唾液酸化高表达者比低表达者更易发生覆膜种植和远处转移(分别为67%和43%;P值<0.01),通过对α-2,3-连接的唾液酸化与不良预后相关的特性,针对此过程的靶向治疗可降低卵巢癌中上皮间充质转化,而降低转移能力。

三、异常糖链糖蛋白与临床应用

异常糖链糖蛋白(tumor abnormal protein,TAP)最初由Kostyantin A.和Galakhin发现,指蛋白质的异常糖基化,这是一种由异常蛋白与钙组蛋白构成的复合物,是通过肿瘤细胞代谢分泌的含有异常糖链的蛋白。间接说明了细胞癌变的数目与程度[33]。

在机体恶变过程中,糖链的改变通常早于蛋白质并更为明显。在早期肺癌检测中,一个重要指标是血液中TAP表达的增加。据研究,TAP检测肺癌的灵敏度高达86.25%[34],有望在早期诊断肺癌、提供筛查和监测疾病方面提供可能性。

目前临床上TAP的应用逐渐增多,检测原理主要是异常糖链糖蛋白和凝集素发生多级偶联反应,两者反应形成的中心具有折射特性的巨型类晶体颗粒,用显微镜观察,呈现规则的圆形或类圆形,颜色为浅绿色、浅黄色或棕色[33]。由于正常细胞不分泌异常结构,所以TAP与一般测定生物标志物数量的方法相比,假阳性的概率降低了,特异度提高了。

关于TAP检测应用与疗效评估及预后方面,一项纳入手术切除的NSCLC患者和正常患者的研究中[35],结果发现,TAP在NSCLC患者中的表达水平明显高于非癌症患者,而在NSCLC患者中,TAP的表达在手术后明显减少。该研究还深入分析了TAP表达与NSCLC患者生存期之间的关系,高表达肺癌患者的预后比低表达患者的预后差,证实TAP的表达水平能够对NSCLC患者的预后进行相应的预测。

四、小结与展望

由于肺癌对人的生命健康造成严重威胁,且发现时大多已是晚期,生存期较短,死亡率较高。CEA、SCC等单独检测有局限性,联合可提高效率。近年来针对异常糖基化的研究备受关注,相应的检测手段日渐更新,只是由于体内糖链形式多变,即使某些已经明确与恶性肿瘤相关的糖链却受限于检测手段,只能在实验室小规模应用,难以普及临床。但相信会随着技术的改进,未来能够出现经济简便、快速准确的异常糖链检测方法,更好地在疾病诊断、预后及疗评方面作出准确判断,并可以此为靶点,研发新型药物,延长患者预期寿命。