宏基因组二代测序在感染性疾病精准诊断中的应用进展

胡丽玲,杨晓云,郑 纺

(天津市人民医院 特殊检查实验室,天津中医药大学 中西医结合学院,天津300121)

感染性疾病(infectious disease)是由病原微生物引起的疾病的统称,目前仍然是全球公共卫生重大威胁,传统的病原学诊断方法已不能满足临床诊断和治疗的需要[1]。与传统病原学诊断方法(培养、质谱法、免疫相关抗原抗体检测和核酸检测技术等)比较,宏基因组学的二代测序(mNGS)是一种非靶向广谱病原学筛查技术,近几年发展迅猛已广泛应用于感染性疾病病原微生物的精准诊断,特别是在危重、疑难、罕见、新发病原体导致感染的诊断。

1 宏基因组二代测序概况

宏基因组学的临床应用起源于2000年初微阵列技术的应用。该项技术早期的一些成功应用包括SARS冠状病毒的发现、癌症突变的基因图谱,以及对人体不同部位微生物组的深入分析[2]。宏基因组二代测序无需预设、无需培养、无偏好性,通过提取临床样本中DNA或RNA片段,直接对样本中所有核酸进行高通量测序、数据库比对和智能化算法分析,能够快速、准确的判断致病病原微生物的种类(包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等)。此外,mNGS检测可以覆盖全样本类型包括脑脊液、体液、脓液、拭子、肺泡灌洗液、组织、痰液、血液等,而且可显著提高低病原含量无菌体液样本的阳性率。mNGS主要操作流程包括:样本的采集与处理、提取核酸、文库构建、上机测序、信息分析、报告解读;其一次可测得上万种病原体,可检测新发、罕见、跨物种传播、混合感染病原体以及培养阴性的病原体,尤其适用于疑难、危重、特殊感染性疾病的诊断[2-3]。

2014年,新英格兰医学杂志报道了1例14岁男孩患有联合免疫缺陷重症脑膜脑炎,应用传统的多项病原检测技术均未能发现导致感染的病原体,随后患儿脑脊液mNGS检测诊断为钩端螺旋体感染,开启了全世界对mNGS的关注[4]。MIAO等[5]对511例临床样本研究发现mNGS对感染性疾病诊断的敏感性高于培养(50.7%vs 35.2%),针对结核分枝杆菌、病毒、厌氧菌、诺卡菌和真菌的检测优势也非常明显,而且受先前抗生素暴露的影响较小,是一种很有前途的传染病检测技术。多项临床研究表明mNGS在感染性疾病诊断研究中非常有潜力,如确诊博卡病毒[6],鹦鹉衣原体[7]、水痘带状疱疹病毒[8]、细小单胞菌[9]、阿米巴脑膜炎[10]、裂头蚴病感染[11]等。最值得关注的是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的COVID-19,mNGS 技术能够检测到样本中所有的病毒基因序列,从而识别出新型病毒,还能够通过比对基因序列找到变异位点,协助寻找中间宿主及病毒起源[12]。

2 mNGS在中枢神经系统感染性疾病诊断的应用

中枢神经系统感染性疾病主要包括脑炎、脑膜炎以及脊髓炎等,具有高发病率和病死率的特点,快速准确的检出病原菌,给予患者及时有效的诊疗对改善患者的预后具有重要意义。传统的诊断流程很大程度上依赖于病原体特异性检测,有时还需要侵入性外科手术,且需要数天到数周的时间。近几年,应用mNGS辅助诊断中枢神经系统感染性疾病越来越受到重视,在中枢神经系统感染的精准治疗中发挥重要作用。

WILSON等[13]进行的大样本、多中心前瞻性研究,共纳入美国8家医院204例儿科和成人患者,调查了脑脊液mNGS检测对感染性脑膜炎和脑炎的诊断价值。该研究发现13例(22%)仅由mNGS 确诊的病例中7例(54%)帮助临床启动治疗,6例通过mNGS进行了耐药基因、病毒分型、动态监测、进化分析等深入分析。由mNGS和常规检查共同确诊的19例,通过mNGS检测到多种病原体如:圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、戊型肝炎病毒、EB病毒、无乳链球菌、脑膜炎奈瑟菌、法氏诺卡氏菌、热带假丝酵母菌、克雷伯菌属产气杆菌、米特斯链球菌、粪肠球菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌和新型隐球菌等。一项单中心、前瞻性队列研究表明,在中枢神经系统感染患者的细菌性感染中无论采用何种抗菌药物治疗mNGS均优于培养法和其他常规方法;接受经验性抗菌药物治疗的患者用常规方法检出率显著降低约20%,而mNGs检出率不受影响;在培养阴性患者中,mNGS额外检测出48种细菌和真菌[14]。另有结核性脑膜炎(TBM)患者相关研究发现脑脊液标本mNGS诊断结核分枝杆菌的敏感性可达84.4%,明显高于抗酸杆菌(AFB)、BACTECTM MGIT 960培养(MGIT 960)、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和Xpert MTB/RIF检测的诊断性能,与T-SPOT相比未显示出明显优势,但两者结合在一起可弥补临床常规检测的不足,最大化提升脑脊液结核杆菌的检出率[15-16]。PIANTADOSI等[17]对中枢神经系统感染患者进行脑脊液RNA和DNA的mNGS分析,检测到蜱传播的病原体波瓦桑病毒、伯氏疏螺旋体和嗜吞噬细胞无形体,还发现了地理相关的中枢神经系统感染性疾病,如新英格兰的蜱媒感染。

3 mNGS在呼吸系统感染性疾病中病原学诊断的应用

3.1 肺部感染病原体的诊断

呼吸系统感染是造成全球死亡人数最多的一类感染,下呼吸道感染(LRTIs)发病率和病死率在成人和儿童中位居第4位,2019年死亡人数达260万[18]。近年来分子生物学方法在感染性疾病病原检测中表现突出,如DNA限制性内切酶分析技术、核酸探针杂交技术、聚合酶链反应(PCR)技术和环介导等温扩增(LAMP)技术等,但仍有50%左右的呼吸系统感染无法明确病原体[19]。mNGS 可大大提高呼吸系统感染病原体诊断效率,也是mNGS应用最广泛的领域。借助mNGS检测可以获得肺部病原体微生物组的概况,其在病原体检测中提供了足够的准确性和更高的灵敏度,能够辅助重症肺炎诊断,尤其是应用传统培养方法难以观察的病原体[20]。

QIAN等[21]对100例肺部感染患者的呼吸道样本进行了常规方法和mNGS检测,该研究显示mNGS对病原菌和真菌的检测灵敏度高于传统培养(95%vs54%,P<0.001);mNGS诊断病毒感染的敏感性低于PCR,但它发现了14种常规方法无法检测到的病毒,包括多种亚型的人类疱疹病毒;mNGS检测对病毒基因组覆盖率>95%,为流行病学研究提供了可靠的信息。该研究建议当临床怀疑存在混合或罕见病原体感染时,尤其是在免疫功能低下和(或)需要紧急治疗的病情危重的患者,应及时使用mNGS。CHEN等[22]对235例疑似肺部感染患者采集支气管肺泡灌洗液(BALF)标本,应用mNGS和微生物培养技术评价其对肺部感染的诊断价值。该研究表明BAL标本的mNGS检测可为肺部感染性疾病提供更准确的诊断信息,mNGS在描述多微生物生态系统、展示不同基础疾病患者呼吸道微生物分布和优势菌株方面比微生物培养更有优势。BAL的mNGS对肺部感染病原体的诊断敏感性为88.89%,特异性为14.86%,阳性预测值(PPV)为21.16%,阴性预测值(NPV)为83.87%。单纯肺部感染患者和免疫功能低下患者中感染类型以细菌感染(58.33%)和混合感染(43.18%)为主。LIU等[23]研究还发现mNGS对经支气管镜肺活检(TBLB)标本病原微生物测序的敏感性优于肺泡灌洗液,而与肺泡灌洗液相比其特异性降低;mNGS对肺组织中病原菌的检测尤其是肺部难治性感染性疾病具有较高诊断价值,包括巨细胞病毒肺炎、吉氏肺囊虫肺炎(PCP)、肺曲霉病和肺结核;此外,mNGS还协助诊断非感染性肺部并发症如移植物抗宿主病(GVHD)、特发性肺炎综合征(IPS)和迟发性肺毒性综合征(DPTS)。CHEN等[24]研究还在1名27岁的男性患者会厌组织和气管肺泡灌洗液(BALF) 通过mNGS检测发现了组织胞浆菌,而会厌组织和肺病理均未见阳性结果。

3.2 协助诊断社区获得性肺炎

社区获得性肺炎(CAP)是威胁婴幼儿及老年人群健康的常见感染性疾病,mNGS还可以协助诊断免疫缺陷患者社区获得性肺炎[25-26]。有研究应用mNGS对121例社区获得性肺炎患儿的支气管肺泡灌洗液标本进行病原体检测,mNGS的诊断性能阳性符合率为86.78%(105/121),高于常规方法(培养和靶向聚合酶链反应试验)阳性符合率为66.94%(81/121)的诊断性能;使用mNGS 与常规方法联合检测诊断的患者比例增加到99.18%;其中仅mNGS确诊的患者占17.36%;肺炎链球菌占52.38%,合并感染占23.8%;此外,仅用mNGS检测到百日咳博德氏菌和人博卡病毒(HBoV)[27]。

3.3 病毒及厌氧菌的诊断

RNA病毒在呼吸系统感染性疾病中占有重要地位,在检测呼吸道RNA病毒方面mNGS也优于RT-PCR和多重PCR,对于不排除病毒感染的患者进行mNGS检测时,可同时进行DNA及RNA检测。有研究应用RNA mNGS评估SARS-CoV-2 RT- PCR阴性中的替代病毒感染频率和SARS-CoV-2 RT-PCR阳性中的病毒复合感染频率,mNGS鉴定了常规临床检查检测到的所有病毒(甲型流感病毒、人偏肺病毒、人冠状病毒OC43、人冠病毒HKU1);mNGS还发现了常规临床检查未检测到的吸道合胞病毒(RSV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人类冠状病毒NL63等[28]。mNGS检测与qRT-PCR能够优势互补,可最大化的实现各自的临床诊断价值。张文宏团队首次结合qRT-PCR、CRISPR和mNGS对首个COVID-19输入性病例进行了快速诊断[29]。此外,mNGS技术对呼吸系统厌氧菌感染的精准化诊断方面具有优势,厌氧菌感染的病原体检出的阳性率为71.43%(10/14)显著高于培养的阳性率7.14%(1/14)(P<0.01)[30]。

呼吸系统与外界相通,正常菌群微生物组成复杂,大量条件致病菌与感染菌的鉴别困难。不同呼吸系统感染类型优选标本类型也不同,不同的标本类型检测结果判读标准不尽相同,为进一步保障mNGS结果准确性,国内已发表多个专家共识[31-33]。

4 mNGS在血液系统感染性疾病病原学诊断中的应用

血流感染病原体随着血流播散至全身各组织器官,除了能够对组织器官造成直接损伤外,还能够引起内分泌、代谢、凝血、免疫炎症反应的异常,最终导致脓毒症、感染性休克及多器官功能障碍[2]。血流感染控制不佳导致的脓毒症甚至感染性休克,是危重患者死亡的重要原因。全球每年报告的脓毒症发病人数为1940万,与脓毒症相关的死亡人数为530万[34]。血流感染诊断的“金标准”是血培养(Blood Culture),然而传统血培养的阳性率低于20%,至少需要3～5天,对于特定的细菌培养物、结核分枝杆菌和真菌则需要更长的培养时间;对诺卡氏菌、隐球菌、布鲁氏菌阳性率较低,病毒无法培养[35]。

有研究显示在血流感染发作前几天,mNGS通过血液中游离细胞DNA(mcfDNA)序列可以识别出与临床相关的病原体,从而可能实现提前干预治疗。mcfDNA-seq对所有血流感染的预测敏感性为75%(95%可信区间为51%～90%),对细菌性BSI的敏感性为80%(95%置信区间为55%～93%)[36]。GRUMAZ等[37]从48名脓毒症患者的256份连续7个时间点的血浆样本中,分离出mcfDNA,在整个研究期间血培养阳性率仅为11%,而mNGS阳性率为71%;急性脓毒症患者中mNGS阳性率为96%,根据专家评估其中53%的病例更换或给予更充分的治疗。斯坦福大学急诊医学中心对纳入的350例脓毒症患者比较了mNGS与传统培养方法在脓毒症患者中的诊断价值,结果显示mNGS诊断脓毒症病原体的敏感性92.9%,特异性62.7%;其阳性率显著高于传统培养阳性率(48.6%vs18.1%),mNGS平均检测时间为29小时[38]。另有研究纳入124例ICU重症脓毒症患者,不仅发现mNGS检测病原体阳性率明显高于传统血培养,还发现1例肺孢子虫、1例结核病原体及罕见的吉罗维肺孢子虫[39]。国内林威等[40]研究报道应用mNGS检测协助诊断3例无焦痂儿童恙虫病,而传统检测方法未能确诊病原。血液mcfDNA mNGS检测不仅可用于诊断血流感染,还可用于诊断深部感染或难以取样的部位感染 (如侵袭性真菌感染、 肺炎或骨髓炎)[41]。

5 mNGS在其他感染性疾病中病原学诊断的应用

mNGS技术在其他系统感染性疾病的诊疗中也有较高的诊断价值。殷楚强等[42]研究表明mNGS对疑似脊柱感染患者的诊断与临床最终诊断一致性较好,mNGS检测发现常见化脓性脊柱炎的病原微生物为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、链球菌;其他常见感染类型为脊柱结核、布鲁杆菌脊柱炎,还发现了脆弱拟杆菌、微小微单胞菌、齿垢密螺旋体、贝纳柯克斯体等少见病原微生物。LI等[43]研究证实应用mNGS从福尔马林固定角膜标本中可检测出大多数感染性角膜炎患者的真菌、细菌和阿米巴病原体,还发现了其他潜在病原体如巨细胞病毒。mNGS在消化系统感染中的应用也有研究,例如1例发热和腹痛的患者应用mNGS能够快速诊断马尔尼菲篮状菌感染[44]。此外,mNGS是免疫缺陷患者中如肿瘤、器官移植患者病原学诊断的很好的补充,尤其适用于器官移植后、免疫缺陷和长期使用免疫抑制剂患者的严重感染。如快速精准诊断免疫缺陷病人卡氏肺孢子虫感染[45]。

6 总结

综上,mNGS技术是传统病原学检测方法的补充和延伸,能够快速、客观检测出临床样本中的多种病原微生物,在感染性疾病精准诊断中显示出巨大临床应用价值。尽管有越来越多的关于mNGS成功的报道,但短期内仍无法完全取代传统病原学诊断方法,有一些技术瓶颈需要解决,如mNGS检测的大量序列属于宿主,可能导致病原体序列比例低,影响病原体检测的敏感性。从呼吸道、口腔和生殖道采集的标本中,很难区分正常定植菌和致病菌。病原体基因数据库制备缺乏统一、全面、准确的参照数据库;对细胞内细菌和厚壁微生物的检出率较低。由于基因型与表型不一致,点突变导致的耐药、毒力变化难以检测,暂时无法满足病原体耐药及毒力分析。对于感染性疾病患者病原体的判定需要依赖于报告解读者对于mNGS检测、医学微生物、感染病学知识有所积累的经验,临床医师对待mNGS检测结果应结合临床实践综合判断。随着测序技术的改进以及更多的实践经验和评估,未来mNGS将朝着临床应用规范化、规模化、精细化、自动化方向发展,助力感染性疾病精准诊断。