13C NMR分析食用油甘油酯组成的方法研究

肖新生, 谢依琳, 刘 芳, 蒋黎艳

(湖南科技学院化学与生物工程学院,永州 425199)

食用油脂中的甘油酯主要是甘油三酯(Triglyceride,TG),也含有少量的甘油二酯(Diglyceride,DG)、甘油一酯(Monoglyceride,MG)和游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)。将TG与甘油在酶催化或碱催化的条件下进行甘油解,可以获得含有MG、DG、FFA、TG的甘油解产物。通过进一步的分离可以获得高纯度的MG或DG产品。由于MG、DG在乳化、起酥等方面的特殊性能[1,2],众多研究者在合成及纯化方面开展了大量的研究工作[3-7]。因此建立一种快速有效的产品组成检测方法,具有非常重要的意义。目前检测甘油酯中各组分含量的方法有高效液相色谱法[8-11]、气相色谱法[12,13]、薄层色谱法[14,15]和柱层析法[16]等。这些方法有效解决了研究过程中的反应过程和产品质量监控问题,但仍或多或少存在分析时间长,有机溶剂用量多,绿色环保性差的缺陷。因此进一步开发快速、稳定性好、绿色环保的分析方法具有重要的意义。

核磁共振波谱分析技术(NMR)作为分析鉴定有机化合物结构的手段,在有机化学研究领域具有重要的地位。随着近年核磁共振波谱分析仪在我国的逐渐普及,有关该技术在食用油脂研究方面的应用也有越来越多的报道[17-21]。研究前期采用核磁共振氢谱(1H NMR)建立山茶油甘油解产物组成的分析方法[22]。但由于1HNMR谱化学位移范围比较窄(0～12),吸收峰之间比较容易交叉,积分有时会受到交叉峰的干扰,导致数据分析处理难度较大。同时1H NMR谱对于游离脂肪酸(FFA)难于找到特征峰,对于FFA含量的分析无法实现。13C NMR谱化学位移范围比较宽(0～250),因此吸收峰之间交叉的可能性大大降低,特征峰的识别容易。同时FFA能够识别到特征峰,可以进行游离脂肪酸含量的分析。因此,建立13C NMR谱分析食用油甘油酯组成的方法具有较好的应用前景。

研究首先制备不同食用油MG、1,2-DG、1,3-DG、FFA和TG样品,然后对其进行13C NMR分析。接着通过识别各谱图中的特征峰及其峰面积,采用面积归一法确定了各组分的相对质量分数。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

可可脂、棕榈油、山茶籽油、橄榄油、菜籽油、芝麻油、玉米油、葵花籽油、大豆油和猪油:市售;石油醚(分析纯)、正己烷(分析纯)、无水乙醚(分析纯)、叔丁醇(分析纯)和甘油(分析纯);2,7-二氯荧光素(分析纯)、氘代氯仿购于阿达玛斯;脂肪酶Novozym 435;200目柱层析硅胶。

1.2 主要实验仪器

BrukerAvance III HD400型核磁共振波谱仪,RE-52A型旋转蒸发仪,C-MAG HS7型加热磁力搅拌器,SHB-III型循环水式多用真空泵,DL-400型循环冷却器,C381730C型具砂板存储球层析柱。

1.3 实验方法

1.3.1 甘油解产物制备的方法

将8.80 g食用油与0.44 g甘油(质量比20∶1)投入100 mL两口烧瓶中,往瓶中加入0.176 g脂肪酶Novozym 435(油质量的2%)作为反应的催化剂,加入20 mL叔丁醇作为溶剂,并在瓶中放入1粒四氟磁力搅拌子,在两口烧瓶的其中一个接口装上磁力搅拌器的温控探头,另外一个接口接冷凝回流装置。将两口烧瓶放入60 ℃的磁力搅拌器中加热反应24 h,冷却后过滤除去酶,然后旋转蒸发脱除溶剂。

1.3.2 柱层析法分离产物的方法

向C381730C型具砂板存储球层析柱中加入硅胶石油醚溶液(150 mL石油醚+60 g硅胶),加压压紧后,加入1 g样品。首先用纯石油醚进行洗脱,洗脱出来的组分为甘油三酯。接着改用V石油醚/V乙醚/V甲酸=70/30/1混合溶剂为洗脱剂,依次得到游离脂肪酸(FFA)、1,3-甘油二酯(1,3-DG)和1,2-甘油二酯(1,2-DG)。收集完成3个组分后,最后改用V乙醚/V甲酸=100/2混合溶剂进行洗脱,得到甘油一酯(MG)。收集得到的各组分分别脱除溶剂后即得到山茶油MAG、1,2-DAG、1,3-DAG、FFA和TAG的纯品。将5个样品分别称重并计算各个组分的相对质量分数,即得到样品各组分的质量百分比含量。柱层析过程中以2,7-二氯荧光素为显色剂,采用TLC监测组分。

1.3.3 核磁共振波谱分析仪测试样品13CNMR的方法

没有特殊说明的情况下,取200 mg样品,加0.5 mL氘代氯仿为溶剂,采用BrukerAvance Ⅲ HD400型核磁共振波谱仪进行测定。核磁共振碳谱(13CNMR)采集条件:脉冲序列zgpg30,扫描次数(NS)=100,脉冲宽度(P1)=30 μs。根据方法优化的需要,可以对样品量,扫描次数,脉冲宽度等进行更改。

1.3.4 Mestrenova 12.0软件分析样品13CNMR谱图的方法

得到的13C NMR谱图,采用Mestrenova 12.0软件处理,首先进行相位校正,基线调平,采用软件标注各个峰的化学位移值,接着对化学位移值为14.2的端甲基峰面积定义为100,最后相应特征峰进行面积积分,得到样品各特征峰的面积,根据纵坐标刻度值,读取峰高。利用纯度物质的链烷基碳、甘油骨架碳和羰基碳面积比,确定不同种类碳的响应系数。各组分特征峰面积与响应系数的积,占总体的比例即为摩尔比,再根据各个组成的分子质量,即可计算出各个组分的相对质量分数。

2 结果与讨论

2.1 甘油酯及游离脂肪酸核磁共振13C NMR谱特征峰的识别

对采用柱层析纯化得到的茶油甘油一酯(MG)、1,2-甘油二酯(1,2-DG)、1,3-甘油二酯(1,3-DG)、游离脂肪酸(FFA)和甘油三酯(TG)进行核磁共振13C NMR谱分析。山茶油甘油酯的13CNMR谱对比分析图如图1所示,不同的甘油酯和游离脂肪酸存在2个特征峰区,分别是化学位移δ为170～180的羰基碳原子特征峰区,化学位移δ为60～76的甘油骨架碳原子的特征峰区。化学位移δ为14.2的特征峰为脂肪酸烷基链的端甲基碳原子吸收峰,该峰可以作为定量分析的参照。

图1 山茶油甘油酯的13CNMR谱对比分析图

将山茶油MG、1,2-DG、1,3-DG、TG和FFA混合后的样品分析后,得到的13C NMR谱羰基特征峰区放大后,山茶油甘油酯的13C NMR谱羰基特征峰对比分析图如图2所示。TG的特征峰化学位移δ为173.09和172.69,其面积比为2∶1,分别对应甘油三酯1,3-Sn位羰基碳和2-Sn位羰基碳。1,2-DG的特征峰化学位移δ为173.30和173.54,其面积比为1∶1。2-MG的特征峰化学位移δ为173.85,1-MG的特征峰化学位移δ为173.98。FFA的的特征峰化学位移δ为177.09,通过多个谱图对比发现,该特征峰的化学位移δ值会在175～180之间波动。

图2 山茶油甘油酯的13CNMR谱羰基特征峰对比分析图

第2个特征区在化学位移δ为60～75之间,山茶油甘油酯的13C NMR谱甘油骨架碳特征峰对比分析图如图3所示,该区域的峰是甘油骨架上碳原子的吸收峰。甘油(G)Sn-2位的化学位移为72.48,Sn-1,3位的化学位移为63.03;2-MG特征峰的化学位移δ为74.65;1-MG特征峰的化学位移δ为70.12、64.91、63.30,其中64.91处的特征峰与1,3-DG的峰有重叠;1,2-DG特征峰的化学位移δ为71.99、62.34、60.96;1,3-DG特征峰的化学位移δ为67.77、64.82,64.82处的峰与1-MG的峰有重叠;TG的特征峰的化学位移δ为68.89、62.02。

图3 山茶油甘油酯的13CNMR谱甘油骨架碳特征峰对比分析图

2.2 油脂种类对核磁共振碳谱特征峰化学位移及面积影响研究

为了考察不同种类油脂的核磁共振碳谱(13C NMR)的化学位移及特征峰面积是否存在差异,选取了饱和酸含量较高的可可脂和棕榈油、油酸含量高的橄榄油和山茶油、亚油酸含量较高的葵花籽油和大豆油、以及菜籽油、芝麻油、玉米油、等9种常见植物油进行分析比较。不同种类食用油甘油三酯特征峰的相对面积见表1,研究发现甘油三酯4个特征峰化学位移值δ分别在173.09～173.32、172.69～172.90、68.85～68.89、62.02～62.11之间波动,波动范围为0～0.23之间,同时未发现脂肪酸不饱和度与化学位移偏移值之间有相关性。利用MestReNova软件对各样品13C NMR谱图数据进行积分,可以得到不同种类食用油甘油三酯特征峰的相对面积。

食用油甘油三酯2个羰基碳的特征峰相对面积的相对标准偏差的结果分别为2.00%和2.15%,甘油骨架上的碳的2个特征峰相对面积的相对标准偏差结果分别为1.78%和1.70%。食用油脂肪酸组成对特征峰的化学位移和特征峰的面积没有显著影响,测定的结果的准确性不受食用油种类的影响。同时研究中对比了几种常见油脂的甘油一酯和甘油二酯的谱图,不同油脂DG和MG的13CNMR谱对比分析图如图4所示,油脂种类对甘油一酯和甘油二酯羰基碳和甘油骨架碳特征峰的化学位移没有影响。通过相对峰面积积分,发现各个特征峰的面积响应值是一致的。

图4 不同油脂DG和MG的13CNMR谱对比分析图

2.3 核磁共振波谱分析条件对测定结果的影响

2.3.1 油脂用量对核磁共振碳谱的影响研究

核磁共振碳谱(13C NMR)与核磁共振氢谱(1H NMR)相比,信号强度弱,需要通过增加样品用量或增加扫描次数来提高峰的强度。而峰的高度,将影响测试的灵敏度,进而影响检测限。山茶油为测试对象,比较用量为25、50、100、200、300、400 mg的13C NMR谱图,通过MestReNova进行积分,发现油脂用量对特征峰的相对面积没有影响,但是对于特征峰的峰高有非常重要的影响。当样品扫描测数恒定为100次时,基线高度均为26,将特征峰高度与基线高度相比,得出信噪比与样品用量的关系曲线,特征峰高度与基线高度比随样品用量的变化曲线如图5所示。δ为62.11的甘油Sn1位与Sn3位碳特征峰具有最大的信噪比。油脂的用量越多,信噪比越大。但是氘代试剂的用量为0.5 mL,样品量超过400 mg,会造成溶解困难。如果样品熔点较高,还需要酌情减少样品质量。样品质量低于100 mg,在扫描100次的情况下,会使得信噪比变小,同一个样品多次测试和积分的数据重复性变差。

注:0.5 mLCDCl3,核磁P1设为为10,扫描100次。

2.3.2 扫描次数对核磁共振碳谱的影响研究

通过增加扫描次数,可以将信号叠加而提高检测的灵敏度。选取山茶油作为研究对象,取100 mg油脂,分别扫描5、10、15、25、30、50、100、200、300、500次,将得到的谱图通过MestReNova软件进行处理,得到的山茶油特征峰相对面积和峰高,不同扫描次数山茶油甘油三酯特征峰的相对面积及峰高对比见表2。当扫描次数在50次及以下时,测定的各特征峰的峰面积误差相对较大;扫描次数在100次以上时,峰面积趋于稳定。

表2 不同扫描次数山茶油甘油三酯特征峰的相对面积及峰高对比

通过研究信噪比(特征峰峰高与基线高的比值),发现随扫描次数的增加,样品信号峰增强的速度明显高于基线高度增加的速度。特征峰高度与基线高度比随扫描次数的变化曲线如图6所示,信噪比与扫描次数之间的关系基本与幂函数接近。hδ62.11/h基线,y= 4.285 1x0.480 2,R2= 0.992 5;hδ68.85/h基线,y= 2.771 6x0.483 4,R2=0.991 5;hδ172.69/h基线,y=2.330 2x0.435 6,R2= 0.977 8;hδ173.09/h基线,y=4.139 4x0.432,R2= 0.985。当扫描次数在100次以下时,信噪比随扫描次数增加的数据很快;扫描次数100次以上时,信噪比还是不断增加,但是增加的速度逐渐放缓。

图6 特征峰高度与基线高度比随扫描次数的变化曲线

2.3.3 脉冲宽度P1对核磁共振碳谱的影响研究

研究中设置脉冲宽度P1在5～60 μs之间,考察山茶油甘油三酯各特征峰,相对面积和特征峰峰高与基线高的比值(信噪比)的变化情况。特征峰相对峰面积及信噪比随脉冲宽度P1的变化曲线如图7所示, P1值对各个特征峰的相对面积有影响。其中羰基碳受到的影响相对较小,而甘油骨架上碳受到的影响较大。尤其是化学位移值为62.11的的峰,随着P1值从5μs向60μs的改变中,相对峰面积呈现先增大,后减少的趋势,并在P1为45 μs时表现出极大值。总体来看,P1在30～50 μs之间,特征峰面积较大。具有较大的信噪比而从特征峰峰高与基线高比值来看,P1在15～30 μs之间具有较大的信噪比。综上,选择P1为30 μs较为合理。

图7 特征峰相对峰面积及信噪比随脉冲宽度P1的变化曲线

2.4 定量计算公式的推导

以脂肪酸酰基链末端甲基碳(化学位移δ为14.16)特征峰面积为参照,将其面积设定为100,分别对TG、1,2-DG、1,3-DG、2-MG、1-MG和FFA的羰基碳和甘油骨架碳特征峰进行积分,茶油甘油解各组分特征峰化学位移及相对面积见表3。每分子TG有3个脂肪酸烷基端甲基碳、3个甘油骨架碳和3个羰基碳,每分子DG有2个脂肪酸烷基端甲基碳、3个甘油骨架碳和2个羰基碳,每分子MG有1个脂肪酸烷基端甲基碳、3个甘油骨架碳和1个羰基碳,每分子FFA有1个脂肪酸烷基端甲基碳、0个甘油骨架碳和1个羰基碳。通过对各个纯组分数据的对比分析,发现甘油骨架碳与脂肪酸烷基端甲基碳的峰面积响应系数为0.97∶1,而游离脂肪酸羰基碳与脂肪酸烷基端甲基碳的峰面积响应系数比为0.30∶1。相比与羰基的特征峰,甘油骨架上碳原子的特征吸收峰具有更高的响应系数,测定的灵敏度更高。TG、DG、MG的量,可以采用甘油骨架碳特征峰相对面积来确定,由于FFA无甘油基,因此只能采用羰基碳来进行定量分析。分别选取δ177.09、δ74.78、δ72.10、δ70.22、δ68.85、δ68.36来计算FFA、2-MG、1,2-DG、1-MG、TG、1,3-DG的质量分数。表4中按茶油棕榈酸8.8%、硬脂酸1.1%、油酸82%、亚油酸7.4%、亚麻酸质量分数0.2%计算平均分子质量。对于常见食用植物油,分子质量有所偏差,但造成的误差相比仪器本身的误差,可以忽略不计。茶油甘油解各组分特征峰化学位移及相对面积见表4。

表3 茶油甘油解各组分特征峰化学位移及相对面积

2.5 甘油解产物各组分的含量

取200 mg山茶油甘油解产物,加0.5 mL氘代氯仿为溶剂,采用BrukerAvance Ⅲ HD400型核磁共振波谱仪进行测定。核磁共振碳谱(13C NMR)采集条件:脉冲序列zgpg30,扫描次数(NS)=100,脉冲宽度(P1)= 30 μs。得到的谱图经Mestrenova 12.0软件处理,首先进行相位校正,然后基线调平,接着对化学位移值为14.2的端甲基峰面积定义为100,最后相应特征峰进行面积积分,得到样品的碳谱图,茶油甘油解样品中各组成的特征峰及峰面积积分如图8所示。

图8 茶油甘油解样品中各组成的特征峰及峰面积积分

将图8中定量积分的结果代入表4中的公式,得到各组分的相对质量分数,13C NMR法测定茶油甘油解产物各组分相对质量分数见表5。

表5 13CNMR法测定茶油甘油解产物各组分相对质量分数

2.6 柱层析法与核磁共振碳谱法的对比分析

取1g山茶油甘油解产物(与采用核磁共振法的甘油解反应液样品相同),采用硅胶柱层析法分离。依次分离得到山茶油甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FFA)、1,3-甘油二酯(1,3-DG)、1,2-甘油二酯(1,2-DG)和甘油一酯(MG)。由于柱层析未能分开1-MG与2-MG,因此1-MG与2-MG合并记为MG。将6个组分分别称重计算相对质量分数,重复6次,柱层析法测定茶油甘油解产物各组分相对质量分数见表6。与表5中核磁共振碳谱法测定的数据对比,平均值接近。由于核磁法对低含量的2-MG进行了定量,其相对标准偏差大些,FFA、DG的相对标准偏差相当,而柱层析法对低含量的TG,相对标准偏差较核磁共振要大些。

表6 柱层析法测定茶油甘油解产物各组分相对质量分数

研究进一步利用单因素方差分析,对核磁共振法和柱层析法测定的FFA、MG、1,2-DG、1,3-DG和TG相对质量百分含量的数据(表5与表6)进行比较分析,结果表明,各个组分的F统计量(F)与F临界值(Fcrit)相比,均呈现F

2.7 核磁共振碳谱法的检测限与定量限

为了探讨核磁共振碳谱检测各个组分相对含量的检测限,研究中向200 mg甘油三酯中,各添加甘油三酯0.5%～20.0%的FFA、MG(1-MG与2-MG的混合物,m1-MG∶m2-MG=0.086∶0.914)、DG(1,3-DG与1,2-MG及少量TG的混合物m1,2-DG∶m1,3-DG∶mTG=0.264 2∶0.611 6∶0.124 3),甘油三酯中添加低含量FFA、MG和DG的13C NMR测定值与实际组成对比表见表8中实际值所示。将样品测定后的谱图,采用MestReNova软件分析后,甘油三酯中添加低含量FFA、MG和DG的13C NMR谱对比分析图如图9所示。FFA检测的灵敏度最低,当质量分数为1%时,峰高仅为基线高度的2.4倍,不符合统计分析中有关检出限信噪比≥3的要求,不能认定为检出。以游离脂肪酸含量x为横坐标,信噪比y为纵坐标,得线性方程y=165.3x+0.767(R2=0.999)。由线性方程可以计算出,当FFA质量分数1.35%时,S/N=3,可以认定为检出。按定量限为检出限3.3倍的算法,游离脂肪酸的定量限为4.45%。按照同样的方法,得出1-MG、2-MG、1,2-DG和1,3-DG的检出限分别为0.52%、0.43%、0.74%、0.36%,而1-MG、2-MG、1,2-DG和1,3-DG的定量限分别为1.7%、1.4%、2.4%、1.2%。

表8 甘油三酯中添加低含量FFA、MG和DG的13C NMR测定值与实际组成对比表

图9 甘油三酯中添加低含量FFA、MG和DG的13C NMR谱对比分析图

3 结论

通过确定核磁共振碳谱中TG、1,3-DG、1,2-DG、1-MG、2-MG和FFA的特征峰及其响应系数,确定样品中各个组分的摩尔比,然后依据各组分相对分子质量,来计算甘油酯样品中各组分的相对质量分数。对核磁共振碳谱进行重复性计算和误差分析,发现该测定方法对于常见食用油,不受食用油脂种类的影响。该方法不仅可以用于甘油一酯、甘油二酯制备过程中反应程度的监控,也可用于产品纯化效果的检验,还可用于食用油脂中少量DG、MG和FFA的检测。研究中测定各组分是相对质量分数,没有考虑甘油的影响,下一步将开发内标法进行绝对含量的测定。同时还将考察甘油酯中脂肪甲酯含量的检测,为生物质能源开发提供技术支持。