基于细胞体外培养筛选最适胎牛血清

游小燕，何琦琳，范骁玲，葛良鹏

1.重庆市畜牧科学院，重庆 荣昌 402460；2.农业农村部养猪科学重点实验室，重庆 荣昌 402460；3.养猪科学重庆市市级重点实验室，重庆 荣昌 402460

相对动物模型来说,体外培养的细胞模型排除了遗传、营养、环境等因素的影响,实验结果重复性好[1-2],还减少了实验研究对动物模型的依赖[3-4]．自20世纪50年代以来,胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)作为最常用、最有效的添加物,在世界范围内被广泛应用于体外细胞培养[5]．胎牛血清富含血浆蛋白、多肽、激素、生长因子等活性成分,能改变培养基的黏度、渗透压、缓冲能力等理化性质[6],可促进细胞的生长与增殖[7]．细胞生长的好坏与胎牛血清密切相关,在细胞体外培养过程中,若血清选择不当,不仅会导致实验结果不可用,还造成人力、物力等资源的浪费．

胎牛血清是一种成分复杂的混合物,虽然其组份大部分已知,但仍有部分活性物质因浓度低无法检测或缺乏相关活性物质检测标准等因素至今仍不清楚[8]．目前尚不能通过检测胎牛血清活性成分组成与含量直接判断血清质量好坏,也没有标准表明某类型细胞适合什么样的胎牛血清,特别是不同来源的胎牛血清,其补体、内毒素等含量差异较大,会直接影响细胞的生长与死亡,因此不同细胞类别选择合适的胎牛血清便成为一个重要的问题．本文通过使用不同来源的胎牛血清培养小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)与猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFF),探索细胞系与原代细胞对胎牛血清需求的差异,以期筛选出这两种细胞的最佳血清,为这两种细胞模型的研究与应用提供保障．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

Sp2/0购自美国细胞培养物收藏中心(ATCC),PFF来源于重庆市畜牧科学院自制的35胎龄荣昌猪胎儿成纤维细胞．

1.1.2 主要试剂

DMEM(Gibco,10829-018),Advanced RPMI 1640(Gibco,12633-012),GLutaMAX (Gibco,35050-061),NEAA (Gibco,11140-050),Sodium Pyruvate (Gibco,11360-070),Pen Step (Gibco,15140-122),FBS1(赛业,特级胎牛血清),FBS2 (BI,04-002-1C),FBS2-1(BI,04-002-1C,2052257),FBS2-2 (BI,04-002-1C,2053268),FBS2-3(BI,04-002-1C,1826596),0.05%胰酶(Gibco,25300-062)．

1.1.3 主要仪器

二氧化碳培养箱,Thermo fisher scientifle;倒置荧光显微镜,Leica;细胞计数仪,上海睿钰生物科技有限公司．

1.2 方法

1.2.1 Sp2/0复苏及培养

根据胎牛血清来源分别配制含10%FBS,1mmol/L Sodium Pyruvate,1x GLutaMAX,1x NEAA,1x Pen Step的RPMI1640完全培养基．从液氮中取出Sp2/0,38.5 ℃水浴快速解冻,加入预热的RPMI1640完全培养基5 mL混匀,5 000 r/min 离心5 min,收集细胞．用1 mL预热的RPMI1640完全培养基重悬细胞,将细胞接种至6孔板内,置于37 ℃,5%二氧化碳培养箱中培养．

1.2.2 PFF复苏及培养

根据胎牛血清来源和批次分别配制含10%FBS,1mmol/L Sodium Pyruvate,1x GLutaMAX,1x NEAA,1x Pen Step的DMEM完全培养基．从液氮中取出PFF,38.5 ℃水浴快速解冻,加入预热的DMEM完全培养基5 mL混匀,5 000 r/min 离心5 min,收集细胞．用1 mL预热的DMEM完全培养基重悬细胞,将细胞接种至6孔板内,置于38.5 ℃,5%二氧化碳培养箱中培养．

1.2.3 Sp2/0细胞克隆培养

Sp2/0生长至65%融合时,用枪头轻轻吹打细胞,收集细胞,用1 mL预热的RPMI 1640完全培养基重悬细胞,并利用细胞计数仪进行细胞计数,将细胞按100个/孔,接种至6孔板内,根据血清来源分为2组,每组3个重复孔,6孔板置于37 ℃,5%二氧化碳培养箱中培养．

1.2.4 PFF细胞克隆培养

PFF生长至85%融合时,用0.05%胰酶消化收集细胞,用1 mL预热的DMEM完全培养基重悬细胞,并利用细胞计数仪进行细胞计数,将细胞按500个/孔,接种至6孔板内,根据血清来源和批次分别分为2组和3组,每组3个重复孔,6孔板置于38.5 ℃,5%二氧化碳培养箱中培养．

1.2.5 细胞克隆观察与计数

每天用倒置显微镜观察细胞生长情况和克隆大小,在细胞接种培养的第7 d,拍照记录细胞克隆大小,并在显微镜下用记号笔圈出细胞克隆,进行细胞克隆计数．

1.2.6 细胞数量与活率检测

在细胞接种培养的第10 d,收集细胞,5 000 r/min 离心5 min,用1 mL温热的完全培养基重悬细胞,取20 μL细胞样本与0.2%的Trypan Blue按1∶1混合,取20 μL混合样本自动检测细胞浓度与活率,利用细胞计数仪检测细胞浓度,按照公式换算出细胞数量(N)：

N=D×V

式中,D表示细胞浓度,V表示细胞体积．

1.2.7 统计分析

2 结果与分析

2.1 不同来源血清对细胞生长性能的影响

由表1可知,无论采用国产FBS1还是进口FBS2培养Sp2/0,其细胞克隆数、细胞数量和细胞活率差异均无统计学意义(p>0.05),但进口FBS2培养的PFF,其细胞克隆数、细胞数量和细胞活率显著高于国产FBS1,差异有统计学意义(p<0.05)．

表1 细胞生长性能测定

2.2 不同批次血清对PFF细胞克隆的影响

PFF细胞培养第7 d,通过倒置显微镜可以观察到：每个批次的血清都有细胞克隆出现,但FBS2-1的细胞克隆明显小于其他组(图1和图2),且FBS2-1的细胞克隆数极显著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01),FBS2-2培养的细胞克隆数极显著低于FBS2-3(p<0.01),但FBS2-2的细胞克隆大．

图1 培养7 d的细胞克隆

***表示p<0.001,差异有统计学意义．图2 细胞克隆数统计图

2.3 不同批次血清对PFF细胞数量的影响

PFF细胞培养10 d,消化收集细胞,利用细胞计数仪检测细胞浓度,并换算出细胞数量．由图3可知,FBS2-1培养的细胞数量极显著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01),FBS2-3培养的细胞数量极显著低于FBS2-2(p<0.01)．

2.4 不同批次血清对PFF细胞活率的影响

PFF细胞培养10 d,消化收集细胞,台盼蓝染色,细胞计数仪检测细胞活率．由图4可知,FBS2-1培养的细胞活率仅为37.27%,极显著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01);FBS2-2与FBS2-3培养的细胞活率差异无统计学意义(p>0.05)．

***表示p<0.001,差异有统计学意义．图3 细胞数量统计图

***表示p<0.001,差异有统计学意义．图4 细胞活率统计图

3 讨论与结论

血清含有人工合成营养液所缺乏的生长激素、生长因子等,为体外细胞培养提供了赖以生存和增殖的物质基础,参与调控细胞生长、增殖、分化等多种生命活动,被广泛应用于细胞的体外培养．根据动物品种不同,血清可分为兔血清、马血清、牛血清等．牛属于大动物,血清来源较为丰富,根据牛日龄的差异,血清又可分为小牛血清、新生牛血清和胎牛血清,其中胎牛因未与外界接触,病原微生物少,血液中富含促生长因子,免疫球蛋白和补体因子(如γ-球蛋白)等[9-10]．血清中还含有近1 800种蛋白[11-12],4 000余种代谢物[13],且血清有助于提高培养基的pH缓冲能力,减少细胞因移液、吹打、消化等造成的物理损伤[14]．自Puck等[15]将胎牛血清添加到培养基中以来,胎牛血清已广泛应用于人、动物以及昆虫的细胞培养．

在本次研究中,无论采用国产还是进口的胎牛血清培养Sp2/0,其细胞克隆数、细胞数量和细胞活率差异均无统计学意义(p>0.05)．这与李自良等[16]的研究结果相类似．究其原因可能是Sp2/0与MDCK同属细胞系,部分遗传物质已发生改变,且带有癌变的特点,能在体外培养条件下无限制地传代,对血清的依赖降低,因此能在各类型血清中较好地生长增殖．研究中还发现：进口胎牛血清培养的猪胎儿成纤维细胞,其细胞克隆数、细胞数量和活率均极显著高于国产胎牛血清(p<0.01)．刘瑞风等[17]利用不同来源胎牛血清培养骨髓间充质干细胞,发现在使用FBS1培养过程中,骨髓间充质干细胞逐渐死亡,而FBS2培养的骨髓间充质干细胞不但能很快贴壁和迅速增殖,而且传代培养后能保持很强的分裂增殖能力．推测可能是因为猪胎儿成纤维细胞与骨髓间充质干细胞属于原代细胞,保持了体内的生物学特性．因不同来源胎牛血清,其采集方式与生产加工工艺不同,所含促细胞生长因子等活性物质的组份与比例也有所不同,导致原代细胞的生长、增殖受血清来源影响较大．

不同来源胎牛血清质量差异大,即使同一品牌、同一货号,因供血动物性别、生理、营养等条件不同,也会存在批次间的差异[18]．本次研究利用猪胎儿成纤维细胞对同一品牌、同一货号,3个不同批次的胎牛血清进行了测试,结果显示：FBS2-1形成的细胞克隆小,且细胞克隆数极显著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01);培养10 d后,FBS2-1的细胞数量和细胞活率极显著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01),虽然FBS2-2的细胞克隆数极显著低于FBS2-3(p<0.01),但是FBS2-2的细胞克隆大,且细胞数量极显著高于FBS2-3(p<0.01)．本次实验筛选出FBS2-2是猪胎儿成纤维细胞的最适血清,可大量采购,为猪胎儿成纤维细胞的培养与应用提供物质保障．