大肠杆菌ydiB基因敲除和过表达对氨基糖苷类抗生素的耐受性分析

蔡雅雯，梅振芳，王玉婵，王 妍

(细胞逆境响应与代谢调控福建省高校重点实验室/福建师范大学生命科学学院,福建 福州 350108)

随着抗生素的广泛开发和应用，细菌的耐药问题日益严重[1-2]。尤其在临床应用上，常用的氨基糖苷类、喹诺酮类和β-内酰胺类药物的耐药性逐年升高[3-5]。为解决抗生素的耐药性问题，微生物学家们不依不饶地寻找新型抗菌药物，然而抗生素周期长、开发不易[1-2]等因素使得其始终追不上细菌的更新速度。因此，仅仅依靠开发新药不能解决细菌耐药问题，寻找新的药物靶标也是尽快解决细菌耐药的方法。近几年来，细菌的一些独特能量代谢途径中的关键酶往往成了理想的药物靶标。例如Singh等[6]发现甲基赤藓糖醇磷酸途径中IspH酶的抑制剂化合物和Surivet等[7]发现UDP-3-O-(R-羟基十四酰)-N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶(LpxC)均对多重耐药菌有杀伤作用，因此这两种关键酶成为开发新型抗菌药物的目标物。尽管抗菌药物新靶标陆续被揭露，但大多数细菌的抗生素药理靶点仍有待开发。

大肠杆菌ydiB基因编码的是莽草酸途径的关键酶。近些年莽草酸途径被报道称是细菌生长所必须的代谢途径，并且该途径成为了筛选新型抗结核分枝杆菌药物的潜在作用靶点[8-9]。也有报道称莽草酸可以抑制变形链球菌的毒力因子[10]，可以破坏金黄色葡萄球菌细胞膜的流动性，因此其具有抗菌活性[11]。由此观之，莽草酸途径与细菌耐药息息相关，然而莽草酸途径的关键基因ydiB与细菌耐药之间的关联则暂无报道。针对ydiB基因，目前研究表明其参与了莽草酸的合成，可通过限制莽草酸途径中间物的质量来提高代谢物流通的效率[12-16]；枯草芽孢杆菌ydiB基因的缺失会降低其生长速率[17]；大肠杆菌PB12中ydiB基因的缺失或过表达会对莽草酸途径中间产物的产量产生影响[18-19]；甚至还有对YdiB蛋白的晶体结构进行剖析，发现赖氨酸和天冬氨酸在其底物结合中起着关键作用等[20-21]。综上所述，ydiB基因与细菌耐药有着怎样的关联，或者说ydiB基因在莽草酸途径与细菌耐药的紧密关系之间是否也扮演着至关重要的角色都有待深究。

因此，本研究采用模式微生物大肠杆菌BW25113(WT)和ydiB基因敲除菌株(△ydiB)开展试验，通过测试大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)对三大类抗生素氨基糖苷类抗生素[22]、喹诺酮类抗生素[23]和β-内酰胺类抗生素[24]的耐受性表现，进一步构建过表达菌株BW25113-pCA24N(ydiB)以及过表达菌株BW25113-pCA24N(ydiB)考察对庆大霉素的耐受性表现，分析ydiB基因与细菌耐药之间存在潜在联系，这不仅为解决大肠杆菌对抗生素的耐药问题提供新的靶点，同时也针对氨基糖苷类抗生素的耐药机理提供新的思路和方向。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌株：大肠杆菌野生型BW25113(WT)和实验室已有的大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)(该敲除的基因被Kana序列所代替，因此敲除株含有kana抗性)。菌种均由细胞逆境响应与代谢调控福建省高校重点实验室保藏。

1.2 试验药品

培养基：LB液体培养基、LB固体培养基、M9+G培养基。上述培养基均经过高压灭菌锅121℃，20 min高压蒸汽灭菌。

抗生素储液：庆大霉素(Genta)25 mg·mL-1、妥布霉素(Tob)25 mg·mL-1、链霉素(Strep)100 mg·mL-1、阿米卡星(Amk)50 mg·mL-1、新霉素(Neo)50 mg·mL-1、环丙沙星(Cip)5 mg·mL-1、氧氟沙星(Ofl)5 mg·mL-1、氨苄西林(Amp)200 mg·mL-1、羧苄西林(Car)200 mg·mL-1、卡那霉素(Kana)50 mg·mL-1、氯霉素(Chl)35 mg·mL-1。上述抗生素配制成溶液，均经过0.22 μm微孔滤膜过滤确保无菌后，储存至-20℃冰箱备用。

试剂：20% PEG3350、0.01 mol·L-1PBS溶液。上述2个试剂均需高压灭菌。10%二甲基亚砜(DMSO)、0.15 g·mL-1葡萄糖(Glucose)、1×TAE缓冲液、6×Loading Buffer、1.5 mol·L-1Tris-HCl、0.5 mol·L-1Tris-HCl、10%SDS-PAGE分离胶、5%SDS-PAGE浓缩胶、1×SDS、1×转膜缓冲液、1×TBST、封闭液、抗体为 ProteinFind Anti-His MouseMonocionalAntibody和Alkaline Phosp hataseconjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H十L)。

1.3 试验方法

1.3.1菌种活化及稀释点板方法 (1)菌种活化。取-80℃保存的大肠杆菌野生型BW25113(WT)和ydiB基因敲除菌株(△ydiB)，分别于LB液体培养基和LB液体培养基(含卡那霉素抗性)中以1∶100的比例过夜活化后，以相同比例分别转接于M9+G培养基和M9+G培养基(含卡那霉素抗性)中培养24 h，即为平台期细菌菌液。(2)稀释点板。分别取处理后的菌液100 μL，利用PBS缓冲液10倍稀释，稀释梯度为100、101、102、103、104、105，每个梯度取4 μL点于LB固体培养基上，倒放至37℃恒温培养箱过夜培养，扫描仪扫描获取板图，统计细菌的存活数。

1.3.2大肠杆菌ydiB基因敲除菌株的鉴定及测序验证 根据目的基因上下游200 bp的序列设计两端引物，以此验证目的基因是否正确敲除。大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)的验证引物上游序列为ATGATGTGCGGTTTGGCGA，下游序列为GCCATCAGCGAGACGATGATT。

将大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)划线于LB固体培养基(含卡那霉素抗性)，37℃恒温培养箱过夜培养。取4个PCR管，加入一定量的ddH2O、Mix和上下游引物并混匀，最后于超净工作台内分别挑取3个大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)的单克隆至3个不同的PCR管中，剩余的最后1个PCR管内加入用LB液体培养基过夜活化好的野生型BW25113(WT)作为对照进行PCR反应。PCR程序：首先将样品94℃预变性5 min，其次94℃变性30 s、55℃退火30 s后72℃延伸90 s，这3个步骤重复30个循环，紧接着72℃终延伸10 min，最后将样品保存至4℃或直接利用1.5%琼脂糖凝胶电泳验证PCR片段大小，Marker选用2K plus DNA ladder(全式金)，凝胶成像仪观察结果。PCR未纯化产物送尚亚公司测序。

1.3.3三大类抗生素对大肠杆菌ydiB基因敲除菌株的杀菌测试 (1)氨基糖苷类抗生素对大肠杆菌ydiB基因敲除菌株的杀菌测试。取平台期大肠杆菌野生型BW25113(WT)和ydiB基因敲除菌株(△ydiB)分别转接至含有5 μg·mL-1庆大霉素、5 μg·mL-1妥布霉素、50 μg·mL-1链霉素、25 μg·mL-1阿米卡星和25 μg·mL-1新霉素的M9+G培养基中处理3 h。(2)喹诺酮类和β-内酰胺类抗生素对大肠杆菌ydiB基因敲除菌株的杀菌测试。取平台期大肠杆菌野生型BW25113(WT)和ydiB基因敲除菌株(△ydiB)分别转接至含有5 μg·mL-1环丙沙星、5 μg·mL-1氧氟沙星、100 μg·mL-1氨苄西林和100 μg·mL-1羧苄西林的M9+G培养基中处理3 h。

1.3.4过表达菌株BW25113-pCA24N(ydiB)的构建及表达 利用实验室已有的大肠杆菌野生型BW25113(WT)感受态和空质粒pCA24N及pCA24N(ydiB)质粒，转化出BW25113-pCA24N和BW25113-pCA24N(ydiB)菌株，并利用免疫印迹法(Western Blot)检测ydiB基因过表达的情况，具体步骤如下：

转化：取-80℃保存的2管野生型BW25113感受态细胞于冰上化冻，分别加入2 μL空质粒pCA24N和2μL pCA24N(ydiB)质粒后置于冰上30 min，42℃金属浴热击90 s，立即将其轻轻地置于冰上2 min；随后向EP管内加入900 μL LB液体培养基，于37℃、220 r·min-1摇床培养1 h后取出；离心去除900 μL上清，剩余100 μL菌液重悬，涂布于LB固体培养基(含氯霉素抗性)上，吹干后倒置于37℃恒温培养箱过夜培养。隔天挑取单克隆至1 mL LB液体培养基(含氯霉素抗性)中，过夜培养，与40%甘油1∶1混合至-80℃冰箱保存。

Western Blot检测：取-80℃保存的BW25113-pCA24N和BW25113-pCA24N(ydiB)菌株，于LB液体培养基(含氯霉素抗性)中以1∶100的比例过夜活化后，以相同比例转接于M9+G培养基(含氯霉素抗性)中培养24 h后，将此刻的菌株分别转接于不含有1 mmol IPTG的M9+G培养基和含有1 mmol IPTG的M9+G培养基中培养1 h。各取出500 μL至无菌1.5 mL EP管中，13000 r·min-1离心2 min，弃上清，以1∶1的比例分别加入10%SDS和6× Loading Buffer，混匀后终体积为50 μL，于100℃金属浴加热15 min，即完成蛋白制样。配置10%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，加入10 μL制好的蛋白样品和5 μLProtein Marker(10～180 kDa)在1×SDS缓冲液中跑胶，电泳结束后，裁剪适宜的Millipore PVDF 0.45 μm膜，用甲醇醒至0.5～1 min后，将蛋白胶取下，切去无样品区域，放置在提前浸泡好的转膜装置黑面，Millipore PVDF 0.45 μm膜随即放在蛋白胶上，闭合并安装好转膜装置后，倒入转膜液，置于冰水混合液中开始转膜。转膜结束后封闭1 h。封闭结束后倒入一抗于水平摇床孵育0.5 h后，放置4℃冰箱过夜孵育。隔天回收一抗，用1×TBST洗脱3次，1次10 min，随即倒入二抗，在水平摇床上孵育90 min，回收二抗，同样用1×TBST洗脱3次，1次10 min。最后配置BCIP/NBT显色试剂，倒入装有Millipore PVDF 0.45 μm膜中于水平摇床缓慢均匀摇晃 5～10 min，观察到蛋白条带后，立即终止显色。

1.3.5庆大霉素对BW25113-pCA24N(ydiB)菌株的杀菌测试 发现大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)只对氨基糖苷类抗生素耐受，想验证是否ydiB基因过表达之后，能恢复对氨基糖苷类抗生素的敏感性。倘若实验结果与设想一致，则ydiB基因将有望成为解决细菌耐药问题的靶点。

取-80℃保存的大肠杆菌野生型BW25113(WT)、ydiB基因敲除菌株(△ydiB)、BW25113-pCA24N和BW25113-pCA24N(ydiB)菌株，分别以1∶100的比例于LB液体培养基、LB液体培养基(含卡那霉素抗性)、LB液体培养基(含氯霉素抗性)和LB液体培养基(含氯霉素抗性)中过夜活化后，分别转接于M9+G培养基、M9+G培养基(含卡那霉素抗性)、M9+G培养基(含氯霉素抗性)和M9+G培养基(含氯霉素抗性)中培养24 h，最后分别转接至M9+G培养基中，在BW25113-pCA24N和BW25113-pCA24N(ydiB)菌株中加入1 mmoL IPTG诱导剂，诱导1 h后，在4个摇菌管中均加入5 μg·mL-1庆大霉素处理3 h。

1.4 数据处理与分析

数据统计采用ANOVA方差分析，试验数据均为3次独立试验取得。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌ydiB基因敲除验证

大肠杆菌ydiB基因的序列被Kana序列替换，从而构成敲除菌株。以大肠杆菌野生型BW25113菌株为对照的琼脂糖凝胶电泳条带应为1044 bp，而Kana基因片段长于ydiB基因片段，则大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)的琼脂糖凝胶电泳条带会高于野生型BW25113(WT)菌株的条带(如图1 A所示)。由图1 B可知，利用Vector NTI软件分析测序结果与NCBI上的Kana序列比对成功，表明ydiB基因敲除成功。

图1 大肠杆菌ydiB基因敲除成功的PCR及测序结果

2.2 大肠杆菌ydiB基因敲除菌株的耐受性分析

2.2.1大肠杆菌ydiB基因敲除菌株对氨基糖苷类抗生素的耐受性分析 由图2可知，在氨基糖苷类抗生素的胁迫下，相比野生型BW25113(WT)，ydiB基因敲除菌株对5 μg·mL-1庆大霉素(图2 A)、5 μg·mL-1妥布霉素(图2 B)、50 μg·mL-1链霉素(图2 C)、25 μg·mL-1阿米卡星(图2 D)、25 μg·mL-1新霉素(图2 E)有较高的耐受现象。综上所述，大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)对氨基糖苷类抗生素耐受，且耐受程度高。

注：****表示在氨基糖苷类抗生素的胁迫下，大肠杆菌野生型BW25113菌株和大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)的存活数具有极显著差异，P<0.0001。

2.2.2大肠杆菌ydiB基因敲除菌株对喹诺酮类和β-内酰胺类抗生素的耐受性分析 由图3可知，在喹诺酮类和β-内酰胺类抗生素的胁迫下，5 μg·mL-1环丙沙星(图3 A)、5 μg·mL-1氧氟沙星(图3 B)、100 μg·mL-1氨苄西林(图3 C)、100 μg·mL-1羧苄西林(图3 D)对大肠杆菌野生型BW25113和ydiB基因敲除菌株(△ydiB)有相同的杀伤力，两者之间无差异。因此，大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)不耐受于喹诺酮类和β-内酰胺类抗生素。

注：NS表示在喹诺酮类和β-内酰胺类抗生素的胁迫下，大肠杆菌野生型BW25113菌株和大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)的存活数没有显著差异，P>0.05。

2.3 BW25113-pCA24N(ydiB)过表达菌株的构建

由图4可知，经过ITPG诱导后才能使ydiB基因表达。与过表达空载质粒菌株对比，BW25113-pCA24N(ydiB)菌株目标蛋白成功表达。

图4 BW25113-pCA24N(ydiB)菌株目标蛋白成功表达

2.4 BW25113-pCA24N(ydiB)菌株对庆大霉素的敏感性分析

以氨基糖苷类抗生素中的庆大霉素为代表，探究BW25113-pCA24N(ydiB)菌株对庆大霉素的敏感性。由图5可知，大肠杆菌野生型BW25113(WT)、ydiB基因敲除菌株(△ydiB)、BW25113-pCA24N和BW25113-pCA24N(ydiB)4个菌株在1 mmol IPTG诱导前后的菌量一致，说明1 mmol IPTG不会对菌株产生毒害作用。当5 μg·mL-1庆大霉素处理3 h后，大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)的表型为耐受，而BW25113-pCA24N(ydiB)菌株的表型恢复敏感，与野生型BW25113(WT)的存活数基本一致。综上所述，ydiB基因的缺失能够干扰庆大霉素的杀菌效果。

注：****表示在庆大霉素的胁迫下，大肠杆菌野生型BW25113菌株和大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)的存活数具有极显著差异，P<0.0001。NS表示在庆大霉素的胁迫下，BW25113-pCA24N和BW25113-pCA24N(ydiB)菌株的存活数没有显著差异，P>0.05。

3 结论与讨论

随着细菌耐药问题逐渐上升为全球性问题，新药的开发周期长难度大，研发速度远远落后于细菌耐药出现的速度，因此挖掘新靶点成为解决细菌耐药问题的有效途径。本研究发现大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)能躲避氨基糖苷类抗生素的杀灭作用，而BW25113-pCA24N(ydiB)菌株能恢复对庆大霉素的敏感性。该结果证实了ydiB基因能干扰氨基糖苷类抗生素发挥杀菌作用，也证实了ydiB基因与细菌耐药之间的潜在联系。

针对ydiB基因如何干扰氨基糖苷类抗生素的杀菌作用还有待后续深层研究。后续的研究可以从氨基糖苷类抗生素已知的杀菌机制入手，思考以下几个问题：是否ydiB基因的缺失导致莽草酸脱氢酶失活，阻断莽草酸代谢途径，迫使大肠杆菌降低细菌跨膜质子动力势，减少对抗生素的摄取？或是迫使大肠杆菌减少蛋白质的聚集？又或是迫使大肠杆菌降低ATP、消耗活性氧自由基等[24-26]？未来，若能揭开大肠杆菌ydiB基因敲除菌株(△ydiB)躲避氨基糖苷类抗生素杀灭作用的机制，则有助于开发对抗细菌耐药的工具。