不同益生菌发酵猴头菇对粗多糖提取工艺及其抗氧化能力的影响

陈寿辉，吴 俐，孙钧政，肖志勇，李怡彬*

[1.福建省农业科学院农产品加工研究所, 福建 福州 350003; 2.农业农村部亚热带特色果蔬菌加工重点实验室, 福建 福州 350003; 3.国家食用菌加工技术研发分中心,福建 福州 350003; 4.福建省农产品(食品)加工重点实验室, 福建 福州 350003;5.福建拓天生物科技有限公司, 福建 福州 350003]

猴头菇Hericiumerinaceus(Bull.)Pers.，为齿菌科，属真菌，在自然界中分布广泛，既是食用珍品也是重要的药用菌[1]。猴头菇多糖具有增强免疫力[2]、抗氧化[3]、抗衰老[4]、降血糖[5]等多方面的功能，在医药保健行业[6]、食品加工行业等有着广泛应用，因此，如何高效制备猴头菇多糖成了其商业化生产的关键步骤。前人研究表明，超声提取法、微波提取法与益生菌发酵法能显著提高多糖提取率。张浩然等[7]利用超声法提取猴头菇多糖，能显著提高多糖提取率；和法涛等[8]利用微波超声波组合提取猴头菇多糖，在最优工艺条件下，多糖提取率为6.44%，显著高于热水浸提法；赵玉洁等[9]发现经乳酸杆菌发酵后，显著提高半枝莲、甘草的多糖提取率；刘涛等[10]利用酵母菌发酵猫抓草，发现猫爪草多糖产量显著提高；Pei等[11]利用益生菌发酵蓝金银花，使其多糖分子量降低，并表现出更强的ABTS自由基清除能力。猴头菇具有坚韧的细胞壁结构，制约着细胞内储存的多糖、蛋白质、脂类等营养物质的有效萃取和产品加工。因此，建立省时、节能、高效的猴头菇细胞破壁技术是多糖等高值天然化合物萃取及其商业化生产的关键环节之一。同时，猴头菇含有蛋白质、脂肪、多糖及单糖等成分，去除猴头菇中的脂肪和单糖等物质是实现高效提取多糖的关键技术。本研究探讨不同益生菌发酵处理猴头菇对其粗多糖提取率的影响，采用正交试验法优化益生菌发酵工艺条件，获得最佳发酵工艺，并考察益生菌发酵对猴头菇粗多糖总抗氧化能力与红外光谱结构的影响，以期为高效制备猴头菇多糖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

猴头菇为市售优质猴头菇，购自福建省古田县。

1.2 主要试剂和主要仪器

主要试剂：葡萄糖、苯酚、无水乙醇、溴化钾、浓硫酸等，均购自国药集团化学试剂有限公司，嗜酸乳杆菌(1000 cfu·mg-1)、长双歧杆菌(1000 cfu·mg-1)购自西安米先尔生物科技有限公司；酵母菌(高糖型)购自安琪酵母股份有限公司；总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒购自北京莱宝科技有限公司。

主要仪器：热泵烘干机组ZWH-KFX-BT12Ⅱ(福建雪丰制冷设备有限公司)；高效粉碎机GFSJ-8(江阴市瑰宝制药机械厂)；微波光波超声波萃取仪SCIENTZ-11DW(宁波新芝生物科技有限公司)；高速离心机GL10MD(湘仪离心机公司)；糖度计PAL-1(秋佐科技ATago爱拓有限公司)；电子天平ME2002E/02[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；紫外可见光分光光度计TU-1810(北京普析通用仪器有限责任公司)；傅里叶红外光谱iCAN9(天津市能谱科技有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1猴头菇水提物与粗多糖提取工艺流程 猴头菇水提物与粗多糖提取工艺流程见图1。

图1 猴头菇水提物与粗多糖提取工艺流程

1.3.2猴头菇预处理 将猴头菇放入50℃热泵干燥中烘干，用粉碎机粉碎后利用索氏提取法抽出猴头菇粉末内的油脂，烘干至恒重，备用。

1.3.3不同提取方式对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响 参考贾冬舒等[12]、樊伟伟等[13]的方法稍做修改，取预处理后的猴头菇粉末与纯净水按1∶25的料液比混匀，分为无处理、超声波处理、微波处理与超声波-微波协同处理4组，设定超声功率为400 w、时间10 min，微波功率90 w、时间30 s、提取4次，经不同处理后采用热水浸提法在90℃下浸提30 min，经6000 r·min-1离心10 min，合并上清液，共提取1次，浓缩后部分冷冻干燥得到猴头菇水提物，部分经醇沉后冷冻干燥得到猴头菇粗多糖。测定猴头菇水提物与粗多糖提取率，并计算提取物中粗多糖含量，并挑选出最佳工艺。

1.3.4不同益生菌发酵对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响 分别称取3 g预处理后的猴头菇粉末按1∶25的料液比与纯净水混匀后，分为酵母菌(高糖型)发酵、长双歧杆菌发酵、嗜酸乳杆菌发酵与未加菌种4组，在对应组加入0.3 g酵母菌(高糖型)、长双歧杆菌与嗜酸乳杆菌，放入不同温度摇床中震荡并调试其pH值，其中，酵母菌(高糖型)发酵环境为pH 4.7、发酵温度28℃；长双歧杆菌发酵环境为pH 6.7、发酵温度39℃；嗜酸乳杆菌发酵环境为pH 5.8、发酵温度37℃。摇床转速为60 r·min-1，培养24 h后，取出在100℃下灭菌10 min后超声波处理，超声功率400 w、超声时间10 min，超声后其余步骤按1.3.3处理，研究不同益生菌对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响，并挑选出最佳益生菌。

1.3.5单因素试验 (1)料液比对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响。称取3 g猴头菇样品粉末设定料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，调节溶液pH为6.7，长双歧杆菌添加量为0.3 g，在温度为39℃下，发酵16 h，其余步骤同1.3.4，研究料液比对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响。(2)发酵时间对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响。称取3 g猴头菇样品粉末按1∶30的料液比与纯净水混匀，调节溶液pH为6.7，长双歧杆菌添加量为0.3 g，在温度为39℃下，分别设定发酵时间为4、8、12、16 h，其余步骤同1.3.4，研究发酵时间对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响。(3)发酵温度对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响。分别称取3 g猴头菇样品粉末按1∶30的料液比与纯净水混匀，调节溶液pH为6.7，长双歧杆菌添加量为0.3 g，分别设定培养温度为36℃、39℃、42℃、45℃，发酵16 h，其余步骤同1.3.4，研究发酵温度对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响。(4)长双歧杆菌添加量对猴头菇水提物和粗多糖提取的影响。称取3 g猴头菇样品粉末按1∶30的料液比与纯净水混匀，调节溶液pH至6.7，分别设定长双歧杆菌添加量为0.15、0.3、0.45、0.6 g，在温度为39℃下，发酵16 h，其余步骤同1.3.4，研究长双歧杆菌添加量对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响。

1.3.6正交试验设计 本试验采用L9(33)正交设计(表1)，根据前期单因素试验固定料液比为1∶20，确定单因素分别为长双歧杆菌添加量、发酵时间、发酵温度，且确定各因素的3个水平，分析各因素水平对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响。

表1 猴头菇粗多糖提取正交试验因素水平

1.3.7猴头菇粗多糖总抗氧化能力 在前期研究中，发现不同提取方法与益生菌发酵后猴头菇水提物提取率和水提物中粗多糖含量有着显著的影响，总抗氧化能力(T-AOC)是体现人体抗氧化能力非常重要的指标，其可以很好地表示人体清除自由基的总能力，测定猴头菇粗多糖的总抗氧化能力以佐证其具有较高的价值，旨为猴头菇深加工与功能评价提供参考。

根据索莱宝总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒进行总抗氧化能力的测定，所得到的回归方程为Y=0.3329x+0.0008，R2=0.9932，线性关系良好。

总抗氧化能力(μmol·g-1)= 34×x÷w

式中，x为Fe2+终浓度值，w为样品质量。

1.3.8猴头菇粗多糖傅里叶红外光谱分析 通过不同益生菌发酵猴头菇粗多糖的总抗氧化能力的影响可知，不同益生菌发酵后其总抗氧化能力各不相同，为了解是否因菌种发酵导致其官能团出现变化，采用傅里叶红外光谱对其进行分析。

取一定量不同处理的猴头菇多糖与溴化钾混合均匀后，在玛瑙研钵中磨至成粉末，压片，采用傅里叶红外光谱在4000～400 cm-1范围内共扫描32次，分辨率为4 cm-1，以空气作为空白背景。

1.4 指标测定

1.4.1猴头菇水提物提取率测定 将冷冻干燥后的猴头菇水提物重量为m，计算猴头菇水提物提取率。

水提物提取率(%)=m÷M×100

式中：m冷冻干燥后的猴头菇水提物质量，g；M为猴头菇样品质量，g。

1.4.2猴头菇水提物中粗多糖含量与粗多糖提取率的测定 参照SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的测定 苯酚-硫酸法》测定猴头菇粗多糖含量。所得到的回归方程为Y=0.0107X+0.0232，R2=0.9971，线性关系较好。

样品的测定：取1 mg的猴头菇水提物与猴头菇粗多糖，用蒸馏水分别定容至10 mL，配置为100 ug·mL-1的猴头菇水提物溶液与粗多糖溶液，如上方法测定吸光度值，参照葡萄糖标准曲线计算样品多糖含量，进而计算猴头菇粗多糖提取率：

水提物中粗多糖含量(%)=m1÷m2×V1×0.9×10-4×100%

猴头菇粗多糖提取率(%)=m3÷m4×V2×0.9×10-4×100%

式中：m1为标准曲线上查得猴头菇水提物溶液中含糖量，单位为ug；m2为猴头菇水提物质量，单位为g；V1为猴头菇水提物溶液定容体积，单位为mL；m3为标准曲线上查得猴头菇粗多糖溶液中含糖量，单位为ug；m4为猴头菇样品质量，单位为g；V2为猴头菇水提物溶液定容体积，单位为mL；0.9为葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数。

1.5 数据处理

采用Excel 2021 、SPSS Statistics 26对数据进行分析和作图。

2 结果与分析

2.1 提取方式对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响

由图2可知，与无处理组比较，微波处理组、超声波处理组、超声波-微波协同处理组猴头菇水提物提取率与粗多糖含量显著增加(P<0.05)，超声波处理组水提物提取率显著高于其他处理，超声波-微波协同处理组水提物中粗多糖含量最高，但与超声波处理组无显著差异。超声波处理组猴头菇粗多糖提取率达4.19%，与黄越等[14]用超声波辅助提取法相比粗多糖提取率提高0.27%。因此后续试验选择超声辅助提取方法提取猴头菇粗多糖。

注：不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

2.2 不同益生菌发酵对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响

由图3可知，与未加菌种组相比较，嗜酸乳杆菌发酵组与酵母菌(高糖型)发酵组水提物提取率显著减小(P<0.05)，长双歧杆菌发酵组水提物提取率相较未加菌种组无显著差异。经过长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌与酵母菌(高糖型)发酵后，猴头菇水提物中粗多糖含量与粗多糖提取率都显著提高(P<0.05)，其中粗多糖提取率分别提高5.31%、7.36%和3.15%。因此后续试验选择长双歧杆菌来发酵猴头菇。

2.3 料液比对猴头菇粗多糖提取率的影响

由图4可知，随着料液比的增加，猴头菇水提物与粗多糖提取率都随之降低，料液比为1∶20时粗多糖提取率最高，达到9.43%，这可能是由于水增加导致溶液中长双歧杆菌浓度下降，发酵作用减小，溶出效率变慢。料液比为1∶25时溶液黏稠且猴头菇粉末不易溶解易挂壁，结合水提物含量与水提物中多糖含量的结果可知1∶20的料液比最佳，得到的多糖含量最多。

图4 料液比对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响

2.4 发酵时间对猴头菇粗多糖提取率的影响

由图5可知，随着发酵时间增加，猴头菇水提物提取率无显著变化，而粗多糖含量与粗多糖提取率呈先上升后下降趋势，这可能因为长双歧杆菌在发酵前期主要消耗猴头菇中的还原糖、蛋白质，随着时间延长，长双歧杆菌开始分解猴头菇多糖，导致水提物中粗多糖含量减少[15]，在发酵8 h时，猴头菇粗多糖提取率达到最大值为13.55%。

图5 发酵时间对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响

2.5 发酵温度对猴头菇粗多糖提取率的影响

由图6可知，随着发酵温度的增加，猴头菇水提物提取率的影响相对较小，且没有显著关系。而水提物中粗多糖含量与粗多糖提取率呈先升高后降低的趋势，当发酵温度为42℃时，猴头菇粗多糖溶出率最高，最高值为13.01%。温度过低会使长双歧杆菌生长缓慢，温度过高会使长双歧杆菌活性降低，生长代谢能力下降，适宜的温度会使得菌种活性提高，溶液中脂肪、单糖等营养物质消耗大，使得水提物中粗多糖含量增加[15]。

图6 发酵温度对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响

2.6 长双歧杆菌添加量对猴头菇粗多糖提取率的影响

由图7可知，在长双歧杆菌添加量5%～20%范围内，随着添加量增加，猴头菇水提物提取率及其多糖含量都显著提高，当长双歧杆菌添加量为20%时，猴头菇粗多糖提取率达到14.56%。这可能是增加长双歧杆菌数量后，发酵作用强度增大，使猴头菇的细胞壁酶解速度加快，粗多糖更易溶出[16]，猴头菇粗多糖提取率增加。

图7 长双歧杆菌添加量对猴头菇水提物和粗多糖提取率的影响

2.7 长双歧杆菌发酵猴头菇的正交试验

由表2可知，影响猴头菇水提物提取率的主次因素依次为添加量>发酵温度=发酵时间，通过极差分析初步得到猴头菇水提物提取率最佳方案为A3B3C2，水提物提取率为28.70%。影响水提取物中粗多糖含量的主次因素依次为添加量>发酵时间>发酵温度，通过极差分析初步得到提取液中粗多糖含量最佳方案为A3B1C2，水提物中粗多糖含量为64.00%。影响猴头菇粗多糖提取率的主次因素依次为添加量>发酵温度>发酵时间，通过极差分析初步得到粗多糖提取率最佳方案为A3B1C2，猴头菇粗多糖提取率17.28%。

表2 长双歧杆菌发酵猴头菇L9(33)正交试验结果

对比最优组合A3B3C2与A3B1C2，猴头菇水提物提取率分别为28.70%与27.00%，水提取物中粗多糖含量分别为52.18%与64.00%，粗多糖提取率分别为14.98%与17.28%，A3B3C2水提物提取率略微高于A3B1C2，其余指标都低于A3B1C2，因此选择A3B1C2为最佳发酵工艺，在此最佳工艺条件下进行3次平行试验，测得水提物提取率平均值为27.85%，水提取物中粗多糖含量平均值为62.87%，粗多糖提取率平均值为17.51%，都与正交试验中各项结果吻合，表明最佳发酵工艺条件稳定，重复性好。因此最佳发酵工艺如下：长双歧杆菌添加量为20%、发酵时间4 h、发酵温度42℃。

2.8 不同益生菌处理对猴头菇粗多糖总抗氧化能力的影响

由图8可知，酵母菌发酵后的多糖总抗氧化能力最高，达到6.07 umol·g-1。除酵母菌组外的其他3组之间没有显著关系，表明长双歧杆菌与嗜酸乳杆菌发酵对猴头菇粗多糖的总抗氧化能力没有显著影响。益生菌在发酵过程中可水解一些结合酚，释放游离酚，提高生物利用率，同时降低多糖分子量，从而提高抗氧化能力[17]，而不同菌种水解效率不同，导致总抗氧化能力各不相同。

图8 添加不同益生菌猴头菇多糖的总抗氧化能力

2.9 不同益生菌发酵对猴头菇粗多糖傅立叶红外光谱影响

由图9可知，4个处理粗多糖的红外光谱在500～2200 cm-1和3000～4000 cm-1处基本相似，说明具有相似的官能团，在3300 cm-1～3500 cm-1附近处出现吸收峰，说明在多糖中含有O-H伸缩振动吸收峰，说明其存在分子内或分子间的氢键[18]。在1587 cm-1附近出现C=O吸收峰，说明该物质中含有酯酰基结构[19]。在1357 cm-1附近出现C-H变角振动吸收峰，在1075 cm-1附近出现由酯键(-COOR)中C-O伸缩振动引起的吸收峰，说明其含有糖醛酸基团。在770 cm-1附近出现α构型C-H面外弯曲振动吸收峰[20]。不同猴头菇粗多糖的红外光谱之间没有明显的差异，只是峰的位置与强度略微改变，但未使得吸收峰出现变化，这与温雅慧[21]提取的猴头菇多糖红外光谱图中特征峰的位置相似。这可能是因为益生菌发酵后的多糖分子量减少导致的[22]，有研究表明多糖的生物活性与其结构变化有关[23]，这可能改善多糖的生物活性。

3 结论

益生菌菌株嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌和酵母(高糖型)发酵猴头菇后降低了猴头菇水提取物的提取率，但水提物中粗多糖含量与粗多糖提取率显著增加，其中长双歧杆菌发酵猴头菇后其粗多糖提取率最高(11.55%)。益生菌发酵猴头菇的最佳工艺为：长双歧杆菌添加量为20%、发酵时间4 h、发酵温度42℃，在此最佳工艺条件下水提物提取率为27.85%，提取物中粗多糖含量为62.87%，粗多糖提取率为17.51%。不同益生菌发酵后制备的猴头菌粗多糖都具有一定抗氧化能力，是天然抗氧化剂的良好来源，其中酵母发酵后猴头菌粗多糖提取物具有最高的总抗氧化能力，达6.07 umol·g-1，长双歧杆菌发酵后的多糖总抗氧化能力与未经益生菌发酵的多糖没有显著差异(P<0.05)。傅里叶变换红外光谱分析显示，不同益生菌发酵后与未发酵的猴头菇粗多糖的傅立叶红外光谱图基本相似，峰位置略微偏移，具有相似的官能团。

本研究表明长双歧杆菌发酵可以显著增加猴头菌粗多糖提取率，具有良好的抗氧化能力，这为益生菌在食用菌多糖的应用提供了参考，也为进一步开发猴头菌多糖作为天然抗氧化剂应用于食品和制药工业提供科学依据。